白僵菌对根结线虫的药效试验Word文档格式.docx

1、雌虫排泄孔位置偏后。卵囊通常为褐色，表面粗糙，常附着许多细小的砂粒。植物根结线虫的生活习性根结线虫多分布在0-20cm土壤内，特别是3-9cm土壤中线虫数量最多，常以卵或2龄幼虫随植株残体遗留在土壤中或粪肥中越冬或翌年环境适宜时以2龄幼虫从嫩根侵入，繁殖为害1。在日光温室中可终年为害。线虫可通过带虫土或病苗及灌溉水传播。土温25-30，土壤湿度为40%-70%条件下线虫繁殖较快，易在土壤中大量积累，10以下停止活动，55时10分钟死亡1。在无寄主条件下可存活一年。传播途径，黄瓜根结线虫的初侵染源主要传播途径有3个：一是带线虫的土壤及病残体。二是带病粪肥、水、农具等。三是带病种苗、病苗是根结线虫

2、病传播的重要途径，与定植后生产棚室发病密切相关。因此，防治上提倡严把育苗关，培育无病苗，避免定植病苗。 近年来， 随着国家大力倡导农业生产的可持续发展，生物防治越来越受到重视，特别是利用真菌的代谢产物控制线虫病害在国内外已取得了显著的成果5，6。世界上已记载的杀虫真菌约有100 属，800 多种，白僵菌是研究和应用较多的一种， 白僵菌（Beauveria）是目前世界上研究和应用最多的病原真菌之一，它符合生物制剂的一些基本要求，即对温血动物和植物无害，容易培养，致病力强，防治害虫效果好，是一种广谱病原真菌。白僵菌隶属半知菌亚门丝孢纲（Homycetales），丛梗孢目（Moniliaie），丛梗

3、孢科（Moniliaceae），白僵菌属，常见的白僵菌有两种，分别为球孢白僵菌和卵孢白僵菌（Beaoeriatenella（Delacr.）sieln）。 在我国大面积用于防治松毛虫、玉米螟和水稻叶蝉等害虫。至1999 年， 在国际上白僵菌已有17 种产品注册登记7。目前， 利用白僵菌代谢产物控制植物寄生线虫病害的研究在国内外报道较少。白僵菌可产生白僵菌素8、球孢白僵菌素9、卵孢毒素、酶类毒素以及其他毒素， 已经证明白僵菌素（beauvericin）对南方根结线虫（M.incognita）有微弱活性10。白僵菌菌株BD-B038-1、BD-B173、BD-B189发酵液处理黄瓜根结线虫，药效可

4、达90%以上。由此可见，白僵菌属真菌是一类非常有潜力的昆虫和植物寄生线虫生防真菌。但是， 白僵菌生防菌株在应用的过程中通常存在菌株退化的问题，导致生物防治效果的降低。本试验立足于我国丰富的白僵菌资源，通过摇瓶液体发酵，离心机离心后制成发酵液，测定白僵菌发酵液对黄瓜根结线虫的致死率，筛选对植物寄生线虫高毒力的生防菌株，为植物寄生线虫的生物防治提供一条新的思路。1 材料1.1 供试线虫黄瓜根结线虫，采自定州市留枣镇西南合村1.1.1 线虫的保存一、较长时间保存 同一地方的样品作为一个群体，同一根及根围土壤作为一个样品。样品带回实验室后先从每个病根挑去3至5个雌虫用于制作会阴花纹再将病根（捣碎）病土

5、直接接种于3至4真叶期经消毒的盆栽幼苗，温室中培养40d左右备用。培养过程中样品间相互严格隔离，防治交叉传播。二、短时间保存 1. 将采集的病根装在塑封袋内，放在10的冰箱内保存，约可以保存一个月。2. 线虫的分离 将病根用清水冲洗干净，放在塑封袋内，但不封闭，室温下放置3d左右，使病根表皮腐烂易于剥离。将病根剪成3-5cm长，放在盛有清水的培养皿中，剥掉根的表皮，挑出卵囊和雌虫，也可通过过筛的方法11分离出卵囊和雌虫，将30目的筛子放在上层，400目的筛子放在下层。此方法更方便，可分离出大量卵囊和雌虫。将卵囊和雌虫放在培养皿中，用0.5%次氯酸钠处理3 min，再用无菌水冲洗3次，置于25培

6、养箱中进行孵化。3 d后孵化出大量2龄幼虫。3.将孵化好暂时不用的二龄幼虫放在培养皿中并加少量水，10保存。1 . 2 虫源土壤的采集 来源于保定12个地区和石家庄2个地区的菜田土壤。1.3 供试菌株由河北农业大学植物保护学院昆虫实验室提供白僵菌菌株BD-B038-1、BD-B173、BD-B189、BD-B102、BD-B180、BD-B005、BD-B213、BD-B 212、BD-B214、BD-B025、BD-B211、BD-B210。表1 本实验所用仪器及型号仪器名称型号来源高速低温离心机Centrifuge 5810 REppendorf冰箱BCD-236DB青岛海尔有限公司超净工

7、作台VS-840k-v苏州安泰空气技术有限公司摇床HZQ-C 空气浴振荡器哈尔滨市东明医疗仪器厂智能生化培养箱GXZ型智能光照宁波江南仪器厂涡旋仪QL-901海门市其林贝尔仪器制造有限公司灭菌锅LD-40SBI型立式自动电热上海申安医疗器械厂天平HC-TP12型架盘天平天津市天马仪器厂移液枪100-1000Leppendorf电磁炉JYC-18T1山东九阳小家电有限公司烘箱筛子30目、60目、400目浙江上虞市华丰五金仪器有限公司表2 本实验所用培养基培养基配方用途PDA培养基马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g， 琼脂20g， 蒸馏水1000ml可用于培养各种真菌PSA培养基马铃薯（去皮）2

8、00g，蔗糖20g， 琼脂20g， 蒸馏水1000ml改良查氏液体培养基（NH4）2SO4 3.67g、K2HPO4 0.64g、MgSO47H2O 1.04g、KCl 0.96g、FeSO4 0.02g、蔗糖28.3g、蒸馏水1000mL用于制备白僵菌发酵液1.4 主要化学试剂 （NH4）2SO4 、K2HPO4、MgSO47H2O、KCl、FeSO4、蔗糖、NaClO2 方法2.1 土壤中线虫的调查2.1.1 病根及土壤采集在土壤0-20cm土壤中采集土样，最好在湿润的土壤中采集。取土的量视需要而定，调查虫口密度时要多一些，一般每块田挖取土样0.5-1kg，分多点采集。植株样本较小时，可连

9、同根和根系土壤一起采回，植株大则只取一部分受害根或根系土壤。2.1.2 土壤含水量测定 用万分之一电子天平准确称量烘干后的培养皿质量，再准确称量20g土样，将土样放于培养皿中，105，2h，得前后的质量差，测其含水量。土样质量烘干后土样质量土样质量100%含水量根据公式可得100g干土样所需的土样质量。2.1.3 线虫的分离每份土样称300g用过筛法分离线虫，将分离出的线虫用涂布器刮至烧杯中，尽量用最少清水将筛子冲洗干净，冲洗液转入量筒中确定其体积。用移液枪吸取200L于载玻片上，显微镜下计数，10次重复。计算每100g干土样中线虫的虫口数。2.2 黄瓜生长后期及下季番茄生长早期虫口分布调查2

10、.2.1 黄瓜后期时，线虫在土壤中分布调查以及虫口数测定采用五点取样法，距离病根10cm范围内，采集深度依次为0-5、6-10、11-15、16-20cm的土样，编号1、2、3、4。2.2.2 番茄早期生长时垂直方向虫口分布调查方法同2.2.1 2.2.3 番茄早期生长时的水平方向虫口分布调查采用五点取样法，距离番茄根16-20cm和36-40cm的范围内，分别采集4cm4cm面积，深度为3-9cm的土样，编号1、2。3 菌株的复壮 复壮是对已衰退的菌种（群体）进行纯种分离和选择性培养，使其中未衰退的个体获得大量繁殖，重新成为纯种群体的措施。由于白僵菌在经过5-6代以后，其孢子产孢量和杀虫活性

11、都将有下降的趋势，所以在做实验之前要先对12个白僵菌菌株进行复壮。31 复壮方法菌悬液的配制： 1. 取保存于植保实验室的白僵菌菌株。2. 于无菌操作台中，用已灭菌的接种针刮取白僵菌孢子至加入Tween-80的无菌水中，用研钵研磨。3. 研磨好后，将其倒入无菌小烧杯中，涡旋振荡混匀，备用。4. 取实验室内饲养的6-9龄黄粉虫6头，在配制好的菌悬液中浸泡3-5s。5. 将浸泡后的黄粉虫放于滤纸上，吸去身上的菌悬液。放于25恒温培养箱中，保持相对湿度在90%左右进行培养。6. 3-4d以后，黄粉虫身上布满白僵菌菌丝。3.2 纯化1. 配制PDA培养基，配好后在无菌操作台中倒入培养皿中，放置1d备用

12、。2. 在虫体表面用接种针挑取几块长势良好的菌丝团，接种于PDA平板培养基上。3. 接种3-4天以后，选取白僵菌生长较纯的平板纯化菌种，并扩大培养。4 白僵菌发酵液的获得25下PSA培养纯化后白僵菌7d，在菌落边缘用0.5mm直径的打孔器打菌饼2个，接种于装有50mL灭菌改良查氏液体培养基的三角瓶内，25摇床震荡培养（150r/min）7d，培养好的白僵菌发酵液经8000r/min离心10min去除孢子和菌丝体，将滤液置于4冰箱中保存备用。4.1 白僵菌活性菌株的筛选 线虫虫悬液的制备 将孵化好的二龄幼虫制备成虫悬液，约400条/mL。取洁净灭菌的贝氏小皿，分别加入200L虫悬液，再向其中滴加

13、200L白僵菌发酵液混匀。以无菌水为对照，每个处理3次重复，放于27的恒温生化培养箱，24h和48h后镜检，处理48h后，采用NaOH刺激法判断线虫死活1。记录供试线虫总数和死亡数，并计算线虫死亡率和校正死亡率12。线虫死亡率（%）=（死亡线虫数/供试线虫数）100校正死亡率（%）=（处理线虫死亡率-对照线虫死亡率）/（1-对照线虫死亡率）4.2 将筛选出效果最好的菌株BD-B038-1梯度稀释后，测其杀虫效果将白僵菌发酵液二倍梯度稀释后测定其杀虫效果，方法同4.15 结果与分析5.1 线虫虫口数调查 5.1.1 线虫分布调查结果本实验通过采集保定12个和石家庄2个不同地区的蔬菜土样，进行线虫

14、虫口数的调查，初步的到线虫的分布状况。本实验调查到保定定州西南合村和定兴龙华黄瓜线虫病害发生严重，定兴龙华线虫的虫口数达2000条/100g干土样，西南合村的黄瓜地线虫虫口数高达4315条/100g干土样，线虫病害非常严重，致使黄瓜严重减产，整个大棚的黄瓜几乎绝收，给蔬菜种植带来毁灭性的灾害。线虫在种植蔬菜的土壤中分布比较普遍，但只有当线虫虫口数达到一定含量时才会影响到植物的生长状况。保定定州的黄瓜、番茄和韭菜是相邻地块，是同一个农民的土地，种植的植物不同，虫口数相差很大。由此可以看出不同种的农作物对线虫的抗性不同。结果见表3.表3 线虫虫口数的调查采集地点样土植物种类条/100g干土样植物生

15、长状况农大东区黄瓜89良好农大西区保定农专番茄321保定唐县番茄139番茄245黄瓜1249黄瓜250保定常青集团茄子石家庄赵县600500保定定兴龙华2000差保定定州4315韭菜100018005.1.2黄瓜根系不同深度的线虫分布状况调查结果显示，调查地块线虫病害非常严重，根结线虫多分布在0-20cm土壤范围内较多，特别是3-9cm土壤中线虫数量最多。表层土壤受水肥、光照、呼吸、耕作等的影响较大，所以线虫分布相对较多。中层土壤是植物根密集生长的地带，水肥、光照、呼吸较稳定，受耕作的影响较小，线虫在中土层中不仅有丰富的食物，又有适宜的环境条件，此条件是植物根结线虫最适宜的生长条件，所以线虫在

16、中土层中分布最多。在深土层中植物根的密集度减少，通透气较差，所以线虫的分布又随深度的增加反而降低。表4 测得黄瓜虫口数的分布编号123443386212381928945.1.3 轮作后线虫的分布情况 表4的黄瓜和表5的番茄为同一地块的轮作植物，表4是黄瓜后期时的线虫分布，表5是番茄定植一个月后的早期时线虫分布状况。该大棚在番茄定植前不仅清理田园，而且闷棚15天。夏季棚外温度38左右，棚内最高温度可达68左右，利用夏季高温闷棚，可杀死大部分线虫，但地面温度高时，有很多线虫向土壤深层移动，仍能存活。所以高温闷棚可以收到一定的效果，但并不能根治线虫。具体见表5.表5 番茄虫口数的分布1500170

17、011007005.1.4 番茄水平方向虫口数的测定线虫在水平方向的分布随与根的距离增加而降低，主要原因是由于受寄主植物的限制。采集3-9cm的土样是因为在此土层中，线虫的虫口数最大。表6 番茄水平方向虫口12008005.2白僵菌发酵液的药效试验5.2.1 白僵菌发酵液初筛结果本试验使用河北农业大学昆虫实验提供的白僵菌菌株，通过测定不同菌株的发酵液对黄瓜根结线虫的致死率，初步筛选出校正死亡率达80%以上的菌株。24h后对线虫死亡率80%以上的菌株有BD-B038-1、BD-B189、BD-B213。48h后对线虫死亡率90%以上的菌株有BD-B038-1、BD-B173、BD-B189、BD

18、-B102，48h后对线虫死亡率80%以上的菌株有BD-B180、BD-B005、BD-B213、BD-B212、BD-B214。白僵菌发酵液对线虫的杀伤作用与所报道的化学农药相比，比较缓慢。白僵菌发酵液对线虫的杀虫效果很好，不同白僵菌菌株发酵液对同种线虫（黄瓜根结线虫）的杀虫效果不同，说明不同菌株的白僵菌的代谢产物不同，其中BD-B038-1菌株对黄瓜根结线虫的杀虫效果最好，进一步对杀虫效果好的BD-B038-1菌株发酵液进行浓度稀释并测其致死率。表7 线虫24h和48h的死亡率及校正死亡率菌株时间死亡率24h24h（校正后）48h48h（校正后）BD-B038-197.56%97.52%9

19、8.78%98.74%BD-B 17369.04%68.55%96.43%96.3%BD-B 18991.76%91.63%95.29%95.14%BD-B 10278.75%78.41%92.50%92.26%BD-B 18028.57%27.44%89.61%89.28%BD-B 00570.67%70.21%89.33%88.98%BD-B21381.25%80.95%87.50%87.09%BD-B 21263.38%62.79%85.92%85.47%BD-B 21448.05%47.23%81.81%81.22%BD-B 02519.77%18.49%79.06%78.39%BD-

20、B21146.51%45.66%61.62%60.37%BD-B 2103.18%1.65%8.53%5.58%ck1.56%3.12%5.2.2白僵菌DB-B038-1发酵液梯度浓度稀释后的杀虫效果视原发酵的浓度为1，由表8可以看出白僵菌BD-B038-1菌株发酵液的杀虫效果随浓度的降低而降低，稀释2倍后对线虫的致死率为96.14%，稀释4倍后对线虫的致死率为93.23%，稀释8倍后的致死率为83.75%，杀虫率也在80%以上。由此可得白僵菌BD-B038-1对黄瓜根结线虫用很好药效，有待进一步的开发与研究。稀释16倍后的致死率为46.91%，杀虫效果差。稀释128倍后的致死率仅为8.51%

21、，几乎没有效果。在实际生产应用中，农药都要求稀释高倍数，而且还要有高的致死率。要想把白僵菌付诸实践中，我们就需要提高原发酵的浓度，比如增大发酵液的接菌量，改良菌株，提高菌株的杀虫活性，以提高白僵菌的药效。表8 BD-B038-1稀释后线虫24h和48h的死亡率及校正死亡率稀释倍数24 h24 h（校正后）15.88%14.55%96.14%96.26%10.56%9.14%93.23%93.44%87.86%6.39%83.75%84.26%166.80%5.32%46.91%48.57%325.74%4.25%18.42%20.99%645.00%3.49%7.10%10.00%1282.7

22、3%5.56%8.51%5.3 白僵菌发酵液对植物寄生线虫致死率差异的比较不同菌株白僵菌发酵液对同种线虫的生物活性作用存在差异。不同白僵菌菌株代谢产物不同，其含量也存在差异，不同的物质对同种类线虫的活性位点又不相同，所以不同菌株的发酵液对线虫的生物活性存在很大差异。已有研究表明，白僵菌可产生白僵菌素、球孢白僵菌素和酶类毒素等。6讨论本实验中为了减少调查虫口数计数时的误差，每次用移液枪吸取虫悬液时，先将线虫虫悬液摇匀后再吸。由于线虫个体小、较活跃，做药效试验时，在显微镜下计数要认真仔细，尽量较少误差。白僵菌在经过5-6代以后，其孢子产孢量和杀虫活性都将有下降的趋势，所以在做实验之前要先对白僵菌菌株进行复壮。参考文献1冯志新.植物线虫学M.北京:中国农业出版社，2001.2段玉玺，吴刚.植物线虫病害防治M.北京:中国农业出版社，2002. 3刘维志.植物病原线虫学.北京:中国农业出版社，20004张春奇，李爱芳，查素娥.番茄根结线虫病的研究概况.长江蔬菜，2003（8）:4143. 5董锦艳.真菌杀线虫代谢物的研究进展J.菌物系统，2001，20（2）:286-29