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1、JIS K9007 磷酸二氢钾JIS K9017 磷酸二钾JIS K9012纺织产品的抗菌性实验方法JIS R3505 玻璃材质的体积计JIS Z 8802 pH值测定方法3、定义本标准使用了如下定义和术语3.1抗菌 抑制产品表面细菌繁殖的状态3.2抗菌剂 直接使用或混合在制品表面以抑制细菌生长的试剂。3.3抗菌加工 以抗菌为目的的加工。3.4抗菌加工制品 被实施抗菌加工技术的制品。3.5抗菌活性值（antibacterial activity） 加工产品和未加工产品进行细菌接种培养后的细菌数进行对数后的差值。3.6抗菌效果 （antibacterial effectivvness） 从抗菌活

2、性值判断抗菌加工产品的效果。4、抗菌加工产品的抗菌效果，根据本标准的试验方法得出，抗菌活性值为2.0以上可判定具有抗菌效果。另外，根据当事人之间的协定，2.0上下的数值均可以。5、试验方法5.1 试验中的细菌试验中所使用到的细菌种类，可根据以下列表，对其细菌逐一进行试验检测。a）金黄色葡萄球菌b）大肠埃希氏菌也可使用与表1所示的菌种。表1 试验用细菌的菌株细菌的种类菌株的保存号码保存菌株的部门Staphylococcus aureus金黄色葡萄球菌ATCC6538PFDA209PNBRC12732CIP53.156DSM346NCIB8625美国典型微生物菌种保藏中心食品药品管理部门日本技术评

3、价研究所生物资源中心法国巴斯德研究所菌物保藏中心德国微生物菌种保藏中心英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心Escherichia coli大肠埃希氏菌ATCC8739NBRC3972CIP53.126DSM1576NCIB85455.2药品、材料，器具及装置本标准所试用的药品，材料，器具及装置，没有特别的规定，如下所示均可乙醇（C2H5OH） JIS K8101规定的1级以上的物品牛肉浸膏 微生物试验用的物品蛋白胨 微生物试验用的物品氯化钠（NaCl） JIS K8150规定的特级物品纯水 适合第15修正日本药局方的基准的物品琼脂 JIS K8263规定的特级以上的物品酵母膏 微生物试验用的物品

4、胰化蛋白胨 微生物试验用的物品葡萄糖 微生物试验用的物品酪蛋白胨 微生物试验用的物品大豆胨 微生物试验用的物品卵磷脂 微生物试验用的物品 非离子表面活性剂 吐温80磷酸二氢钾KH2PO4 JIS K 9007规定的特级物品磷酸氢二钾K2HPO4 JIS K 9017规定的特级物品氢氧化钠NaOH JIS K8576规定的特级物品盐酸HCL JIS K 8180规定的特级物品棉花塞接种环 尖端大约一个4mm的环点干热消毒器 使保持温度在160至180高压灭菌器 能保持121和103KPa 的压力生物安全柜 性能按照或等价于JIS K 3800pH计 JIS Z 8802规定中所使用的pH计天平

5、性能按照或等价于JIS K 0050净化操作台 微生物实验用吸管 精确度能达到或等价于JIS K 0970或JIS R 3505A 级培养箱 保持温度1无菌培养皿 内径90mm的玻璃器皿或是按JIS K 0950中规定规格无菌袋 微生物测试振荡器 （拍打机） 微生物测试薄膜 不能影响微生物生长和吸水、厚度不定，但可以吸附着使用。5. 3 杀菌方法试管、吸管等玻璃试验器具，呈碱性状态时用中性试剂冲洗即可，再用水充分洗净，待干燥之后再进行干热杀菌或者高压蒸汽杀菌处理。具体灭菌方法，详见下列a）至b）.另外，接种环等需要火焰灭菌的情况下使用，详见c）.a）干热杀菌将杀菌对象放入干热杀菌器，在170的

6、情况下进行60分钟以上时间的杀菌，或在160的情况下进行120分钟以上时间的杀菌。但是干热杀菌完成后，杀菌的绵塞，包装物等被水浸湿时，器具不可再用。b）高压灭菌锅将水倒入高压杀菌器，把杀菌物放在铁丝网篮上，盖上高压杀菌器的盖子，加热，温度达到121（压力相当103KPa）后保持1520分钟。加热停止，自然冷却到100以下后，打开排气，排去蒸汽，打开盖子，取出杀菌后的物品，如有必要的情况下在净化操作台内冷却。高压灭菌锅要防止受到培养基和化学试剂的污染，为了保持干净，有必要的情况下可以放到中性洗剂中洗净，再用水充分清洗。c）火焰杀菌将需要灭菌的物体或部分物体放到气体或者酒精的火焰中。接种环应加热到

7、足够的红，试管应解除火焰2-3秒。5. 4 其它培养基使用如下所示组合的培养基。另外，如果成分相同，可以使用市场上销售的产品。a）细菌悬浊液用营养肉汤1/500细菌悬浊液用营养肉汤（1/500NB）准备纯水或者离子交换水1000ml，称取牛肉浸膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，放入烧瓶里混合，充分溶解。用纯水稀释500倍。，用氢氧化钠或者盐酸溶液进行调整PH值，使PH值在6.87.2之间 （25），然后进行高压蒸汽杀菌。配好的1/500NB如果不马上使用，可放到5-10的温度下保存。超过一周以上的1/500NB不能使用。b）营养琼脂培养基准备纯水或者离子交换水1000ml，称取牛肉

8、浸膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，放入烧瓶里混合，全部溶解后，用氢氧化钠或者盐酸溶液进行调整PH值，使PH值在7.07.2之间（25），加入琼脂粉15.0g，加热溶解，塞上绵栓，进行高压蒸汽杀菌。配好的培养基如果不马上使用，可放到5-10的温度下保存。不能使用超过一个月以上的营养琼脂培养基。c） 平板计数琼脂/标准琼脂培养基准备纯水或者离子交换水1000ml，称取酵母膏2.5g，蛋白胨5.0g,葡萄糖1.0g，放入烧瓶里混合， 全部溶解后，用氢氧化钠或者盐酸溶液进行调整PH值，使PH值在7.07.2之间（25），加入琼脂粉15.0g，加热溶解，塞上绵栓，进行高压蒸汽杀菌。不能使用

9、超过一个月以上的标准琼脂培养基。d）斜面培养基准备6-10ml溶解后的营养琼脂培养基b）注入试管内，塞上绵栓高压蒸汽灭菌。灭菌完成后，把试管放在干净的室内保持15倾斜，让试管内的物质凝固。如果没有冷凝水，则重新溶解，凝固后再用。不能使用调至超过一个月以上的斜面培养基。e） SCDLP 肉汤准备纯水或者离子交换水1000ml，酪蛋白胨17.0g，大豆胨3.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢氧二化钠2.5g，葡萄糖2.5g，卵磷脂1.0g，放入烧瓶内混合，充分溶解后，添加非离子表面活性剂7.0g并溶解。用氢氧化钠或者盐酸溶液进行调整PH值，使PH值在6.87.2之间（25），高压蒸汽灭菌。不可使用超过一

10、个月的SCDLP（液体培养基）。f）磷酸缓冲液准备磷酸二氢钾34.0g放到烧瓶内，添加纯水或者离子交换水500ml进行混合，充分溶解后，用氢氧化钠或者盐酸溶液进行调整PH值，使PH值在6.87.2之间（25）。进而，添加纯水或者离子交换水使之达到1000ml。高压蒸汽灭菌备用。不可使用超过一个月的磷酸缓冲液培养基。g） 磷酸盐缓冲生理盐水溶液用生理盐水（0.85%氯化钠溶液）800倍的量稀释磷酸溶液，必要的情况下，注入试管或者三角锥瓶中，塞上绵栓进行高压蒸汽灭菌。调至后，不马上使用的放到5-10的温度下保存。不可使用超过一个月的磷酸盐缓冲液。5. 5 菌种准备菌种的转接要无菌操作，有必要时使用

11、生物安全柜。一手持带有菌种的斜面培养基，另一手持接种环，用这只手拔出棉塞，然后用火焰对试管口和接种环进行消毒，用接种环碰触斜面培养基上的冷凝水使冷却，用接种环从培养基表面刮取部分菌种并在新的斜面培养基上涂开，划线涂抹成条状。此方法根据图1所示，用接种环的顶端置于冷凝水以分散菌种，从冷凝水底部到斜面上方方向，用蘸取冷凝水的接种环的顶端以Z形划线涂抹。 图1 菌种转接对试管口用火焰进行再次消毒，塞住棉塞保持原状。用过的接种环要进行再次消毒，转接的菌种在351下接种培养24-48小时，后储存在5-10温度下，一个月内进行转接，过程同上。菌种传代次数不能超过5次，从最初的菌种从管理部门获得计算。此外，

12、当最后一次转接超过一个月或是更多，则不能被使用。另外，来自菌种管理部门的菌种，经过冷冻干燥、冻结等允许使用长期保存方法保存的情况下，为了保存菌种而进行菌种移植。在试验用时，不能使用超过转接5次的保存菌种。5. 6测试菌种应无菌操作，注意器械、人员、工作环境的污染，必要的情况下使用生物安全柜。a）细菌预培养使用接种环从保藏的斜面菌种5.5转接到斜面培养基5.4d上，在351培养16-24小时，然后从此斜面使用接种环接种到另一个斜面培养基，在351下培养16-20小时。b）准备测试片测试片准备，如下。1.）把样品平的部分切成标准尺寸502mm（厚度为10mm以内）的正方形，如因产品形状问题不能准备

13、，可以采用相同的加工工艺方法生成测试片。测试片尺寸没有特别规定，只要能被薄膜覆盖4001600mm2即可。2.）将无抗菌加工的测试片和经抗菌加工测试片切成相同大小，准备6片无抗菌加工的测试片，使用3个测试片接种后马上测试活性细胞数值，另外3个计算接种24小时后的活细胞数。3.）在没有无抗菌加工测试片的情况下，可使用5.2中的薄膜。测试片的准备过程中可能会发生微生物污染，务必要注意制品间的相互污染以及制品被污染的情况。由于制品的形状导致测试片准备困难的情况下，可以使用原材料或者用同种加工方法制成平板形状的测试片。4.）无抗菌加工测试片准备不足的情况下，准备半数（3个）测试片，在24小时培养后的活

14、细胞数测试中使用这3个无加工测试片，用薄膜替代无抗菌加工测试片，接种后马上测试活性细胞数。当半数（3个）测试片准备不足的情况下，可全部用薄膜替代。c） 测试片清洗用纱布或脱脂棉粘上酒精全面的擦拭测试片b）2-3次，充分干燥。如果经过处理后测试表面变软、表层分开，如果影响实验结果，样片清洗会导致软化、表面涂层溶解及溶出，应该避免清洗，或用没有清洗的测试片，也可用其它适合的方式清洁。d）测试菌液准备用接种环挑取培养好的测试细菌a），均匀分散到少量的1/500NB（营养肉汤）中，通过合适的方法使稀释液的细菌数量在2.5x10510x105个/ml，使用这种菌液当做接种体。如果接种体没有马上使用，在0

15、保存并在2小时内使用。e）测试菌液的接种 1）在接种过程中，将各个试验片c）分别放入无菌平皿中，实验测试面朝上。试 验测试面即为实施抗菌加工的制品表面。抗菌加工工艺在其内部的制品，剪裁制品的所得面并不为试验测试面。 2）用吸管准确吸取0.4ml测试菌液d），并滴入各个平皿中的测试片。非标准测 试片所需要使用的菌液量按其覆盖面大小进行比例分配。即使是非标准测试片，也要按规定中的菌液使用量接种， 测试片很湿,像陶瓷,瓷砖, 瓷釉, 玻璃,也许少许倾斜, 这时菌液就会溢出薄膜。在这种情况下，菌液的量就可以减少到1/4的标准量。如果菌液量被减少，被接种在每个测试片上的细胞数量为6.2x1032.5x1

16、04个/cm2，类似于标准的测试片。3.）在滴下的接种菌液上方覆上薄膜，要注意不要让接种菌液从薄膜的一端溢出，并且为了使测试菌液被薄膜全部覆盖，可用培养皿的盖子上轻轻按压（参照图2） 薄膜的标准尺寸为正方形40 mm 2 mm。如果测试片不是标准的尺寸，将薄膜调整到能覆盖到测试片内的2.5mm5.00mm的大小，调整薄膜的尺寸不小400mm2 。再次，因测试产品的不平整形状等问题不能很好让薄膜吸附在上面，如因测试产品会亲水或吸水问题这个过程可以考虑不用薄膜。不使用薄膜的操作情况下，将5.6b）中的测试片大小调整为402mm（厚度为10mm以内）的标准尺寸即可。 在接种过程中，如果很难阻止菌液从

17、薄膜边缘溢出，可将接种量减少到0.1ml，但菌液浓度要增加，以保证和常规接种量的细菌数量一样。f）接种后测试片培养三个无抗菌加工测试片和三个抗菌加工测试片在无菌平皿中进行24小时 1小时的接种体培养，温度为35 1C相对温度为不少于90%下进行。参考信息：抗菌产品的抗菌有效性从抗菌产品在一定的测试条件下测试中获得的抗菌活性值来评估，但是特定条件温度也要考虑抗菌产品的实际使用环境条件。g） 菌液洗脱 接种后的菌液洗脱如下： 1）接种菌液后直接洗脱的测试片三个无抗菌加工测试片在接种菌液后，用薄膜盖住并用已灭菌的镊子把测试片放置于无菌袋中，注意不要让菌液溢出，吸取10ml的SCDLP溶液，将测试片上

18、的菌液最多以4次洗脱。计算洗脱液中的活细胞数。2）接种菌液并培养后的测试片经培养后的测试片f），洗脱方法同1），并计算洗脱液中的活细胞数。3）菌液洗脱过程中，用镊子将薄膜和测试片放入无菌袋中，注意不要将菌液洒漏，用吸管加入10ml的SCDLP溶液，并用手或振荡器充分按摩薄膜和测试片，计算在洗脱液中的活细胞数量。另外，于此方法达到等同效果的其他方法也可以适用。如果因为产品特性或是尺寸等原因用10ml的SCDLP溶液不能洗脱，可以增加洗脱量。h） 琼脂平皿培养法活细胞数计算用吸管取1ml的洗脱液g），把它放置在有9ml的磷酸盐缓冲液试管中，充分混合，然后从这个测试管中用新的吸管吸取1ml测试液到另

19、外一个9ml磷酸盐缓冲液试管中充分混合，重复这个动作，准备稀释成10倍系列稀释的溶液。吸取1ml溶液到无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿，在每个平皿中加入预热到 46-48 的平板计数琼脂5.4c）15-20ml，并充分混合，平皿加上盖子，放置于室温环境中，凝固后把培养皿翻过来，在351的温度下培养40至48小时。经过培养后，计算各稀释度的平皿中的30到300之间的细菌菌落数。如果用1ml的洗脱液在平板琼脂中细菌数少于30，计算平皿中所有的细菌数量。如果在这个平板琼脂中没有任何菌落生成，记录为 1，进一步，如果细菌的数量没有和稀释率成相反的比例，就要考虑抗菌剂对细菌生长产生的影响。然后决定使用灭

20、活剂或稀释物不影响细菌生长的抗菌剂方法来计算活细胞数量。参考：菌落计数其它方法，参考微生物试验法（平板培养法（贴膜法）日本药学会编制卫生试验法注解2005）；1.2微生物测试法；3）菌落总数测定。厚生省生活卫生局监制的混合平板培养法 食品卫生检查指南微生物版（2004）第2章细菌 2污染指标菌1细菌数标准分析法。5. 7 活菌数的计算活菌数的计算：N（CDV）/A其中 N：每个测试片每cm2的活菌数； C：菌落数；（平皿中读取的菌数） D：稀释倍数， V：用于洗脱的SCDLP 溶液的体积（ml）； A:薄膜覆盖的面积（cm2）另外，就5.6e）3）覆盖薄膜被省略的情况下，A即为抗菌加工测试片或

21、者无抗菌加工测试片的表面积。保留二个有效数字记录活菌数，第三位数字采用四舍五入。菌落数C1的情况下，以C为1对V、A、D的活菌数进行计算。比如V为10ml，A为16cm2，D为1的情况，用“0.63”表示。5.8测试结果测试的结果按下： a）测试的有效性条件 当如下三个条件都得到满足时，这个测试判定有效，除了所有条件都满足才判定该实验有效，否则重做。 1） 如下公式是计算无抗菌加工测试片在接种菌液后马上测试的活菌数对数值。 （Lmax-Lmin）/（Lmean）0.2 其中： Lmax 最大活性细胞对数值 Lmin 最小活性细胞对数值 Lmean 三个测试片活性细胞平均对数值2） 无抗菌加工测

22、试片在接种后马上测试的活菌数范围在6.2x1032.5x104个/cm2。3）所有3片无抗菌加工测试片经过24小时细菌培养后活菌数不少于62个/cm2。如果有薄膜使用在无抗菌加工测试片上时，3片测试片在24小时后活细胞数不能少于6.2x102个/cm2。b） 计算抗菌活性值 当测试有效，按照公式计算抗菌活性值，保留小数一位，第二位小数用四舍五入。菌落数“0.63”的情况时，“0.63”即作为对数的平均值计算。 R=（Ut-U0）-（At-U0）=Ut-At式中： R: 抗菌活性值 U0:无抗菌加工试验片接种后立即测试得到的活菌数平均对数值； Ut:无抗菌加工试验片接种后放置24h 得到的活菌数平均对数值； At:抗菌加工试验片接种后放置24h 得到的活菌数平均对数值；6.实验结果的记录塑料制品等抗菌加工制品的试验结果，如下。a）标准编号及名称b）试验操作日期c）抗菌加工测试片及无抗菌加工测试片的种类、尺寸、形状、厚度d）薄膜的种类、尺寸、形状、厚度e）测试菌种f）菌种的编号g）接种菌液的接种量h）接种菌液的菌落数（每ml）i）清洁方法j）5.8 b）中U0、Ut、A1的值及抗菌活性值，试验地点的名称、责任人的名字以及试验报告的日期k）与本标准偏离的事项等