酶活测定方法Word格式文档下载.docx

1、以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗（No45）过滤,置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。1.1.2 0.4mol碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g,定容至1000mL。1.1.3 0.4mol三氯乙酸（T C A）溶液: 称取三氯乙酸（CCL3COOH）65.4g,定容至1000mL。1.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液（A液）。称取磷酸氢二钠（Na2HP

2、O412H2O）71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液（B液）。取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解（必要时用小火加热煮沸）,然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。1.1.6 100g/mL酪氨酸溶液:精确称取在105烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1

3、000g/mL,再吸取此液10mL,以0.2N盐酸定容至100mL,即配成100g/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。1.2 仪器a. 分析天平: 感量0.1mg;b. 581-G型光电比色计或72型分光光度计;c. 水浴锅;d. 1、2、5、10mL移液管等。1.3 操作1.3.1 标准曲线的绘制1.3.1.1 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液（表1）。表 1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 管 号试 剂 1 2 3 4 5 6蒸馏水,mL 10 8 6 4 2 0100g/mL酪氨酸,mL 0 2 4 6 8 10酪氨酸最终浓度,g/ml 0

4、20 40 60 80 1001.3.1.2 测定步骤:取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL,各加入0.4mol碳酸钠5mL,再各加入已稀释的福林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中。40保温发色20min在581-G型光电比色计上分别测定光密度（OD） （滤色片用65*#）或用72型分光光度计进行测定（波长660nm）。一般测三次,取平均值。将16号管所测得的光密度（OD）减去1号管（蒸馏水空白试验）所测得的光密度为净OD数。为了清楚起见。再列出表格如下 （表2）。表 2按表1制备的不同浓度酪氨酸,mL 1 1 1 1 1 10.4mol/L Na2CO3,mL 5 5 5 5 5 5福

5、林试剂,mL 1 1 1 1 1 1 1 2 O D值 3 平均 净O D值 0 以净O D值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制成标准曲线（或可求出每度OD所相当的酪氨酸量K）。1.3.2 样品稀释液的制备。1.3.2.1 测定酶制剂: 称取酶粉0.100g,加入pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL,吸取此液5mL,再用缓冲液稀释至25mL,即成5000倍的酶粉稀释液。1.3.2.2 测定成曲酶: 称取充分研细的成曲5g,加水至100mL,在40水浴内间断搅拌1h,过滤,滤液用0.1mol pH 7.2磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数（估计酶活力而定）。1.3.3 样品测定: 取15100mm试

6、管3支,编号1、2、3（做2只也可）,每管内加入样品稀释液1mL,置于40水浴中预热2min,再各加入经同样预热的酪蛋白1mL,精确保温10min,时间到后,立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL,以终止反应,继续置于水浴中保温20min,使残余蛋白质沉淀后离心或过滤,然后另取15150mm试管3支,编号1、2、3,每管内加入滤液1mL,再加0.4mol碳酸钠5mL,已稀释的福林试剂1mL,摇匀,40保温发色20min后进行光密度（OD）测定。空白试验也取试管3支,编号（1）、（2）、（3）,测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2mL,使酶失活,再加入酪蛋白。为了清楚起见,分

7、别列出表格于下 （见表3及表4）。表 3 管 号 试 剂 管 号试 剂 1 2 3 （1） （2） （3）预热酶液, mL 1 1 1 预热酶液, mL 1 1 1预热2%酪蛋白, mL 1 1 1 0.4mol三氯乙酸, mL 2 2 2作用10min （精确计时） 作用10min （精确计时） 0.4mol三氯乙酸, mL 2 2 2 预热2%酪蛋白, mL 1 1 1表 4试 剂 1 2 3 （1） （2） （3）滤 液, mL 1 1 1 1 1 10.4mol Na2CO3,mL 5 5 5 5 5 5福林试剂, mL 1 1 1 1 1 1O D值 平均O D值 净O D值 0样品

8、的平均光密度（O D）一空白的平均光密度（OD）=净OD值。1.4 计算在40下每分钟水解酪蛋白产生1g酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。A 1样品蛋白酶活力单位（干基）=4N （1）10 1 - W式中:A由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数（或OD值K）;44毫升反应液取出1 mL测定 （即4倍）;N酶液稀释的倍数;10反应10min;W样品水分百分含量。1.5 注意事项以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶（pH7.2）。若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶,则把配制酪蛋白溶液和稀释酶液用的pH缓冲液换成相应pH缓冲液即可。现把几种常用pH缓冲液配方提供如下:1.5.1 pH7.5磷酸盐

9、缓冲液 （0.02mol/L）12H2O）6.02g和磷酸二氢钠 （NaH2PO42H2O）0.5g以蒸馏水溶解定容至1000mL。1.5.2 pH 2.5乳酸-乳酸钠缓冲液 （0.05mol）A 液: 称取80%90%乳酸10.6g,加蒸馏水稀释定容至1000mL。B 液: 称取70%乳酸钠16g,加水稀释定容至1000mL。取A 液16mL与B 液1mL混合稀释一倍即成。1.5.3 pH 3.0乳酸-乳酸钠缓冲液 （0.05mol） 称取80%90%乳酸10.6g,以水定容至1000mL。 称取70%乳酸钠16g,蒸馏水溶解定容至1000mL。取A 液8mL与B 液1mL,混合稀释一倍即成

10、。1.5.4 pH 10硼砂-氢氧化钠缓冲液 称取硼砂19.08g,用蒸馏水溶解定容至1000mL （0.05mol）。 称取氢氧化钠8g,用蒸馏水溶解定容至1000mL （0.2N）。取A 液250mL,B 液215mL混合,用蒸馏水稀释定容至1000mL即成。1.5.5 pH 11.0硼砂-氢氧化钠缓冲液 称取硼砂19.08g,用蒸馏水定容至1000mL 。 称取氢氧化钠4g,用蒸馏水定容至1000mL 。取A 液与B 液等量混合。1.5.6 2%酪蛋白溶液配成酸性时,须先加数滴浓乳酸,使之湿润以加速其溶解。2 甲醛法成曲蛋白酶活力的测定,如用福林法测定确有困难时,可用甲醛法测定作过渡。2

11、.1 仪器感量0.01g;b. 水浴锅;c. 电烘箱;d. 容量瓶、吸管、滴定管等。2.2 试剂与溶液a. 1%酚酞指示剂;b. 0.1%麝香草酚蓝;c. 0.1N氢氧化钠液、甲醛（试剂配制法同氨基态氮的测定,见ZB X 6603887氨基态氮测定法）。2.3 操作2.3.1 目测法称取研细均匀的成曲样品10g,放入250mL锥形瓶中,加55温水80mL,充分摇匀,置于55水浴锅中保温3h,取出后加热煮沸以破坏酶活力,冷却后定容至100mL,充分摇匀后以脱脂棉过滤,吸取滤液10mL,移至150mL锥形瓶中,加水50mL, 1%酚酞指示剂0.2mL,以0.1N氢氧化钠标准溶液滴定至刚显微红色（p

12、H 8.2）,记下滴定数作为总酸,继续加甲醛10mL,用0.1N氢氧化钠液滴定至深红色（pH 8.5）为终点,若再加麝香草酚蓝1mL作指示剂,则滴至紫红色为终点。记下滴定数,减去空白数后计算成氨基态氮。另称取曲10g做水分,再折算成干基数。2.3.2 酸度计法所用仪器、药品、操作方法等与氨基态氮测定法同 （见 ZB X 66038-87）。2.4 计算蛋白酶活力 （克氨基态氮/100g）（干基）（V-*Vo）0.014 100= （2）10 1 -W10100V加入甲醛后氢氧化钠标准液滴定数, mL;*Vo甲醛空白滴定数, mL;W曲水分,%;N氢氧化钠标准溶液的当量数,N;0.014氮的毫克

13、当量数。附加说明:本标准由商业部副食品局提出。本标准由上海市酿造科学研究所起草。本标准主要起草人须凤高。*本法实质上是在一定温度下、一定时间内,成曲利用自身的蛋白酶把自身原料中的蛋白质水解成氨基酸。以测定氨基态氮的量来衡量蛋白酶活力的数值。在培养和堆放过程,环境温度和自身含有水分,故已有少量氨基酸生成。为了能和福林法的酶活力进行对照,可用空白试验以扣除此误差,方法是另取一曲样于开始时即将成曲酶活杀灭,其余操作步骤完全相同。杀酶的方法是把已煮沸的蒸馏水70mL倾入10g成曲中,并马上继续把成曲液煮沸几分钟,其余操作与样品同,成曲和甲醛的空白一起算成Vo。搜索更多相关主题的帖子: 测定法 蛋白酶

14、活力蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。酶的本质是蛋白质，所以酶在出厂后的长途运输及存放过程中，由于条件的变化、振荡、阳光等的作用，其活力要有所改变，故在使用之前必须测定其活力。作为计算酶制剂用量的依据，以达到预期的脱毛效果。即现测现用。酶的活力是指酶催化底物进行反应的本领。即酶催化底物反应在一定时间内生成物越多或消耗的底物越大，则催化速度越快，活力越高。酶活力的大小用酶活力单位（U，active unit）来表示。1961年国际酶学会议

15、规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。1979年国际生物化学协会为了使酶活性单位与国际单位制（SI）的反应速率相一致，推荐用Katal单位（也称催量，Kat）。规定为：在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。Kat和U的换算关系：1 Kat=6107U，1U=16.67nmol.s-1=16.67nKat。把酶制剂的量和活力联系在一起，即为酶的比活力，它表示单位质量的蛋白质中所含的某种酶的活力单位的多少。是用来度量酶纯度的指标。在实际生产中所说的酶活力一般是指酶的比活力大小。另外在实际的生

16、产应用中，由于酶的性质不同，测定方法不同，很多酶的活力都有各自的惯用单位。1、Folin法（第一法）测定蛋白酶活力目前所用到的蛋白酶的种类比较多。根据每种酶作用的条件不同，主要是最适PH值不同而分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。其中酸性蛋白酶可用于毛皮的软化。在制革上则主要选用中性和碱性蛋白酶来脱毛。定义：lg 固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，l min水解酪素产生lg酪氨酸为一个酶活力单位，以U/g（U/mL）表示。具体测定方法见QB/T 1803-1993 工业酶制剂通用试验方法及SB/T10317-1999 蛋白酶活力测定法。表1 几种酶促反应最佳条件2、胰酶

17、活力测定胰酶系从各种动物胰脏制取的混合物，主要是蛋白酶，脂酶和淀粉酶。白色或淡黄色无定形粉末，有微弱的肉类物臭味。溶于水呈微浑溶液，不溶于醇和醚。遇酸、碱及热即丧失活力，pH7.88.7活性强。水溶液遇酸、热、重金属或单宁酸时产生沉淀，经煮沸则迅速分解而变性。胰酶用于原料皮脱灰后进行软化。胰酶中所含的弹性蛋白酶，可以分解弹性蛋白质，防止成革粒面出现碎玻璃花纹，提高产品质量。胰酶软化时，对皮内一些蛋白质进行不同程度的消解，可除去皮内残存的脏物、毛根分解产物、纤维间质等，有利于皮纤维进一步分散，促进躁剂与皮胶原的结合，以使成革具有柔软性、丰满性和良好的透气性。酶软化是制造软革很重要的操作，但胰酶浓

18、度过高，皮内胶原纤维损失大，致使成革松面。为了达到正常的软化目的，必须在软化之前，测定其活力，以便确定其含量。醋酸盐指示剂法（1）测定原理 胰酶能催化酪蛋白水解，而且胰酶量越多，被水解的酪蛋白就越多。一定量的胰酶，催化的酪蛋白越多或生成的分解产物越多，其胰酶的活力越大。与福林法蛋白酶活力不同的表示是，胰酶活力是用在一定条件下底物的消耗量来表示。即在一定的pH值和时间内1g胰酶能使酪蛋白完全水解的质量（g），即胰酶能使酪蛋白转化的能力，又称酪蛋白转化力，以倍数来计量。控制胰酶的最适条件pH89、T（401），用定量的酪蛋白和不同量的胰酶作用，水解一定的时间后，用醋酸盐（或醋酸）指示剂调节反应液p

19、H值达到酪蛋白的等电点（pH4.6）附近，末被水解的酪蛋白呈白色沉淀析出，而水解产物则不沉淀。据此，则可找到恰好使定量的酪蛋白完全水解的最小胰酶用量。根据胰酶的体积和浓度，即可计算出胰酶对酪蛋白的转化倍数，即胰酶的活力。（2）试剂 1.24:50硼酸水溶液；0.1mo1/L。NaOH水溶液；硼酸盐溶液，即1.24:50的H3BO4 20mL+2mL 0.1mo1/L NaOH；13.6醋酸钠水溶液；60醋酸溶液；醋酸盐缓冲液，即l 3.6 NaAc与60 HAc等体积混合。（3）操作 配制底物酪蛋白 称取（精确至0.0001g）0.2g细酪蛋白于小烧杯中，加20mL蒸馏水，移取5mL 0.1m

20、o1/L NaOH，40水浴上加热约30min，搅拌使之溶解，移人100mL容量瓶，加5mL H3BO4溶液，并定容到刻度（pH8.5）。 胰酶溶液的配制 在研钵中称取（精确至0.0001g）胰酶0.1g（先加35滴研磨，再补加1517滴），加1mL硼酸盐溶液，浸泡35min，研磨到无大块胰酶，转移定容到500mL容量瓶，用H2O定容。 粗测 取5支带刻度的干燥试管，按表1-2所示进行。依次滴加醋酸盐缓冲液0.5mL（10滴），边滴边观察刚加人时是否产生白色沉淀，若缓冲溶液到了试管底部还不出现沉淀，说明酪蛋白已水解完全，有沉淀产生，证明酪蛋白没有全部水解，找出刚不产生沉淀的胰酶体积（mL）。即

21、是5mL酪蛋白完全水解的最少胰酶量。表2 胰酶活力粗测步骤 精确测定 在粗测刚不沉淀至刚沉淀之间移取酶液量，梯度为0.1mL。例如表1-2中2.0mL刚沉淀，则取2.52.0mL。按表1-3所示进行。操作同上，找出刚好不产生沉淀胰酶的量，记为V。表3胰酶活力精确测定步骤（4）计算 胰酶活力X按照下式计算。式中 ml 酪蛋白的质量，g；m2 胰酶的质量，g；V 终点时管中胰酶溶液的体积，mL。（5）注意事项： 酪蛋白、胰酶、水按比例加入以后一定要使其混合均匀，否则将造成试管底部的酪蛋白没有水解，使测定结果不准确。 水浴加热，使整个液面都进入到水中。 试管的粗细程度。试管不可太粗或太细，既好摇匀又

22、好观察，且粗细一致。 配制好的胰酶和酪蛋白溶液在室温20以下存放24h有效，室温高于20时胰酶4h有效，酪蛋白8h有效。 产生白色沉淀必须是现加现看，不能放置过久，否则酪氨酸也沉淀出来了。3.l 还原糖法（Reducing sugar release）这种方法是采用化学合成或从自然界提取的酶的底物来进行的。酶与底物在特定的条件（温度、PH值和底物浓度）下反应。反应产物是还原糖，通过比色确定还原糖的数量，同时制作标准曲线。酶的活性表示为每分钟产生lmmol的产物所需要的酶量（mg或ml）。3.2 比色法（Colorimetric assays ）这种方法是对底物进行化学修饰，使其带有特定的可溶性

23、生色基团物质，该生色基团能够产生特定颜色。在酶与底物发生反应后，生色基团就被释放出来，用分光光度计可以测定颜色的深度，并制作标准曲线。与已知标准酶的活性进行比较，计算出该酶的活性。这种方法并不能区分内切酶和外切酶，但是通常认为这种方法更适合于测定外切酶。目前采用这种方法测定所需的底物被工业上广泛采用。3.3 比色法（Colorimetric assnys）这种方法是通过生色基团结合酶作用底物分子的中间产物（sub-unit）来确定酶的活性。如 PNPG（para nitro phenyl），该种物质与半乳糖结合形成一种乳糖（或葡萄糖）类似物。在酶的作用下，释放出PNP，利用其它方法测定PNP的含量。上述的方法通常只在生物化学实验室采用，饲料酶作用的底物是高