TRIzol法提RNADNA和蛋白质Word格式文档下载.docx

1、亏染注意事项：1. 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为 RNase的 来源。2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交*污染。3.RNA在TRIzol试剂中时不会被 RNase污染，但提取后继续处理 过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150C烘 烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底 清洗，高压灭菌，即可去除 RNase。4.配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻 璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01 % v/v,放置过夜，高压灭菌。注： DEPOT致癌之嫌，需小心操作。）RNA勺提取准备试剂：氯仿，异丙

2、醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5 % SDS溶 液均需用DEPC处理过的水配制）操作步骤 :1.匀浆处理 :a. 组织 将组织在液氮中磨碎 , 每 50-100mg 组织加入 1ml TRIzol, 用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过 TRIzol 体积 10%。b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面 积（即3.5cm直径的培养板）加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用 量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。 TRIzol 加量不足可能 导致提取的RNA有 DNA亏染。c.细胞悬液 离心收集细胞，每5-10 X 106动物、植物、酵母细胞或

3、1X 107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗 涤细胞以免mRN降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。2.将匀浆样品在室温（15-30 C）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完 全分离。3 .可选步骤：如样品中含有较多蛋白质， 脂肪，多糖或胞外物质 （肌肉，植物结节部分等）可于 2-8 C 10000X g离心10分钟，取上清。 离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量 DNA上清中含有RNA处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进 行下一步操作。5.每使用 1ml TRIzol 加入 0.2ml 氯仿，剧烈振荡 15秒，室温放置3 分钟。6.2

4、-8 C 10000X g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相， 上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所 用TRIzol试剂的60%。7.把水相转移到新管中，如要分离 DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的 RNA每使用1ml TRIzol加入 0.5ml 异丙醇，室温放置 10分钟。8.2-8 C 10000X g离心10分钟，离心前看不出 RNA沉淀，离心后在 管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。9.用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75 % 乙醇。2-8 C不超过7500X g离心5分钟，弃上清。1

5、0.室温放置干燥或真空抽干 RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要 真空离心干燥，过于干燥会导致RNA勺溶解性大大降低。加入25-200 卩I无RNase勺水或0.5 % SDS用枪头吸打几次,55-60 C放置10分钟 使RNA溶解.如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100 %的去离子甲酰胺溶解，-70 C保存。注意事项：1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA0寸可加入 少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzoI匀浆样品，沉淀RNA 前加5-10卩g RNase-free糖原。糖原会与 RNA一同沉淀出来，糖原 浓度不高于4mg/

6、ml是不影响第一链的合成，也不影响 PCF反应。2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70 C保存至少一个月。RNA 沉淀可以保存于 75%酒精中2-8 C一星期以上或-5至-20 C一年以 上。3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600X g离心30-60分 钟。预期产量：1mg组织或1X 106细胞提取RNA分别为：肝和脾6-10卩g ,肾3-4卩g ,骨骼肌和脑组织1-1.5卩g ,胎盘1-4卩g ,上皮细胞8-15卩g ,成纤维细胞5-7卩g。常见问题分析：得率低： A. 样品裂解或匀浆处理不彻底B.RNA沉淀未完全溶解A260/A280V1.65 : A.检测吸光度时，RN

7、A样品没有溶于水，而溶于了 TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高B.样品匀浆时加的试剂量太少C.匀浆样品时未在室温放置 5分钟D.吸取水相时混入了有机相E.RNA沉淀未完全溶解。RNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70 C ,而保存在了 -5至-20 CC.细胞在用胰酶处理时过度D.溶液或离心管未经RNase去除处理E.电泳时使用的甲醛pH值低于了 3.5DNA亏染：A.样品匀浆时加的试剂量太少B.样品中含有有机溶剂（如乙醇,DMSC等）,强缓冲液或碱性溶液 蛋白聚糖和多糖污染：沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污 染，步骤7中

8、,每使用 1ml TRIzol 在水相中加 0.25ml 异丙醇和 0.25ml 高盐溶液 （0.8M 柠檬酸钠和 1.2M NaCl） 混合离心 , 按之前操作进行。 这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯 RNA从含有大量多糖的植物中提取RNA寸应在匀浆后离心，并加上以上操作步 骤。DNA勺分离乙醇 0.1M 柠檬酸钠（含10%乙醇） 75%乙醇 8mM NaOH 操作步骤 ：1.样品加氯仿分层后 , 移去上层水相 , 用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA每使用1ml TRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置 3分钟，2-8 C不超过2000X g离心5分钟。2.移去上清，

9、（如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含10沱醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1ml TRIzol加入1ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，2-8 C 2000X g离心5分钟，弃上清， 重复一次。3.用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1ml TRIzol加入1.5-2 ml 75%乙醇，室温放置10-20分钟（不时颠倒混合）2-8 C 2000X g离心5分钟， 弃上清。4.室温放置晾干DNA5-15分钟，用8mMNaOH溶解DNA从50-70mg 组织或107细胞中分离的DNA溶于300-600卩l 8mM NaOH DNA的浓 度通常为0.2-0.3卩g/卩l。提取的DNA沉

10、淀不易溶于水和Tris缓 冲液中，建议用弱碱溶解，8mMNaO的pH值为9,溶解DNA后可用 TE, HEPE碉节pH从某些样品（尤其是组织）中提取的 DNA中可能 包含一些胶状不溶物可12000X g离心10分钟除去。DNA勺定量：取一份溶于8mMNaOH勺DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50卩g/ml双链DNA根据DNA产量可估计细胞数，人，大鼠，小鼠1X 106二倍体细胞含DNA勺量分别为7.1卩g , 6.5卩g , 5.8 卩g 。1mg组织或1X 106细胞提取DNA分别为肝和肾3-4卩g骨 骼肌，脑组织，胎盘2-3卩g人，大鼠，小鼠培养细胞（1X 106） 5-7

11、g成纤维细胞5-7卩g应用：1.用于 PCR溶于 8mMNaOH勺 DNA用 0.1M HEPE碉 pH至 8.4, 取0.1-1 g DNA用作模板。2.酶切反应 用HEPES或 1mM EDTAS节pH至适当值。每 g DNA使用3-5单位的酶，80-90%的DNA是可消化的。1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节Final pH 0.1M HEPES（ l） Final pH 1M HEPES（ l）8.486 7.2 238.2 93 7.0 328.0 1017.8 1177.51591.DNA在中间层和有机相中时可在 2-8 C保存过夜。2.DNA沉淀在75%乙醇中2-

12、8 C可保存几个月。3. DNA在 8mM NaO溶液中4C可放置过夜，如长期保存需用 HEPES 调节pH至7-8并且加EDTA至 1mM可置于4C或-20 C长期保存。 A. 样品匀浆和裂解的不彻底B.最终得到的DNA沉淀没有完全溶解A260/A280V1.70 :了 TE中B.酚除去的不彻底，可用0.1M柠檬酸钠（含10沱醇）再洗一遍DNA 沉淀。DNA降解：C.样品匀浆时使用了高速匀浆仪RNA亏染：A.氯仿分层后水相去除的不干净B. DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠（含10沱醇）洗的不彻底蛋白质的提取异丙醇 含 0.3M 盐酸胍的 95%乙醇 无水乙醇 1%SDS 操作步骤：1.取沉淀DN

13、AB剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol 加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2-8 C 12000X g离心10分钟弃 上清。2.用含0.3M盐酸胍的95临醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1ml TRIzol 加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2-8 C 7500X g离心5分钟，弃上 清，重复两次。用 2ml 无水乙醇同样方法再洗一次。3.真空抽干蛋白质沉淀5-10分钟，用1%SD溶解蛋白质，反复吸打， 50C温浴使其完全溶解，不溶物 2-8 C 10000X g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于 Western Blot或-5至-20 C保存备用。 注意事项：1

14、.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%L醇或无水乙醇中2-8 C 一个月以上或-5至-20 C一年以上。2.用0.1% SDS在2-8 C透析三次，10000X g离心10分钟取上清即 可用于 Western Blot 。B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解 蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻 电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分TrizolTrizol 试剂是可即用的从动物、植物细胞和组织或微生物中提取总RNA的试剂。在样品裂解或匀浆过程中，Trizol可溶解细胞内含物， 同时具有使蛋白变性、抑制 RNase活性的作用，保持RNA的完整性。 可以从富含多糖、脂肪酸、蛋白质及RNas

15、e的样品中获得完整的RNA. 经过 Trizol 试剂处理后的裂解物， 仅仅只需加入氯仿混匀， 离心后， 便分为三种液相：上层水相含有 RNA中层的半固体相含有 DNA下 层的有机相含有少量的DNA和大量的蛋白质、多糖、脂肪酸和其它细 胞碎片。取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA, 一般所得RNA溶于DEPC 水后的 A260/280 值为 1.6-1.8 。Trizol试剂可用于小量样品（50-100 mg组织、5X 106细胞），也可 用于大量样品（ 1 g 组织或 107细胞），对人、其它动物、植物和 细菌组织都适用， 整个操作步骤方便快捷， 一个小时内即可完成反应， 可同时处理大量不同样

16、品。提取的总RNA没有DNA和蛋白的污染，可 用于RT-PCR Northern Blot 、核酸酶保护实验、mRNA分离和体外 翻译等。包装清单：Trizol 50ml 或者100 ml说明书1份保存条件：2-8C保存，本试剂自订购之日起一年内有效。注意事项:1.所有离心管、枪头及相关溶液都必需无 RNA酶污染。耐高温器物 可150C烘烤4小时以除去RNA酶，其它器物除RNA酶可考虑用0.01% 的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌、烘干。溶液需用灭菌的DEPCK配制： 加0.01%（体积比）DEPC至MiliQ 级水中，处理过夜，灭菌即成 DEPC 水。2.必需戴一次性手套操作，且尽量不要对着R

17、NA羊品呼气或说话，以 防RNA酶污染。3.Trizol 含有毒物质苯酚，避免接触皮肤或吸入。为防止溅入眼睛， 请戴防护眼镜或使用透明保护屏。如皮肤接触 Trizol ，请立即用大 量去垢剂和水冲洗，如仍有不适，请听取医生意见。4.需自备氯仿，异丙醇，75%L醇（DEPC水配制），和DEPC水。 使用说明：1.细胞裂解或组织匀浆。a.贴壁细胞：吸尽培养液，按照每 10 平方厘米细胞加入 1ml Trizol ， 晃动 3-5 下，再用枪吹打 2-3 下，确保全部裂解， 然后吸至离心管中。b.悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，每五百万至一千万动植物 或酵母细胞，或一千万细菌，加入 1mlTriz

18、ol 适当 vortex ，确保全 部裂解。某些酵母和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，或者用液 氮研磨，确保全部裂解。c.组织：先将组织剪切成小块，放入普通玻璃匀浆器内，或者用液氮研磨组织样品。每50mg-80m昶织加入1ml Trizol ，匀浆。2.室温静置 515 分钟。对于某些蛋白、多糖或脂含量很高的细胞 或组织， Trizol 裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物，需 12,000x g, 4 C离心10分钟，然后吸取澄清的 Trizol裂解产物至一新 的离心管中。3.按照每毫升 Trizol 加入 0.2ml 氯仿， vortex 混匀或猛烈晃动 15 秒，室温放置 2-3 分钟。

19、5.12,000 x g, 4 C离心15分钟，然后吸取含总 RNA的上层水相至一新的离心管中，每毫升 Trizol 约可吸取 0.5-0.55ml 。6.按每毫升最初的 Trizol 加入 0.5ml 异丙醇,颠倒数次混匀, 室温 沉淀 10 分钟。7.12,000 Xg 4C离心10分钟，在管底可见胶状 RNA沉淀，弃上清。8.每毫升最初的 Trizol 加入 1ml 75%乙醇， vortex 或颠倒混匀，9.7,500 X g 4C离心5分钟，弃上清。再用离心机甩一下（5,000rpm, 离心 1 秒），小心吸尽液体。10.待RNA略干后，加入20微升DEPC水溶解，-70 C冻存。注

20、意，切勿让RNA过分干燥，否则将极难溶解，且测出的 A260/280值会低于 1.6。问题指南低得率：A.样品裂解或匀浆处理不彻底；B.最后得到的RNA沉淀 未完全溶解。 A.检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE,而是溶 于水。低离子浓度和低pH条件下，A280值会较高；B.样品匀浆时 加的试剂量太少；C.匀浆后样品未在室温放置5分钟；D.水相中混 有有机相；E.最后得到的RNA沉淀未完全溶解。A.组织取出后没有马上处理或冷冻； B.样品或提取的RNA沉淀保存于-5 - -20 C,未在-60 - -70 C保存；C.细胞在胰酶处 理时被破坏；D.溶液或离心管未经RNase去除处理；E.电泳时使用 的甲酰氨pH低于3.5。DNA污染：A.样品匀浆时加的试剂体积太少；B.样品中含有组织 溶剂（如乙醇，DMS等），强缓冲液或碱性溶液。蛋白和多糖污染：离心去上清后得到的RNA沉淀经以下操作应可去除 这些污染： 在上一步中，每使用 1ml Trizol ，在水相中加 0.25ml 异丙醇和0.25ml高盐溶液（0.8M柠檬酸钠和1.2 NaCI ）。混合，离 心，然后按照操作进行。这种方法可使蛋白多糖和多糖留在溶液中， 而高效沉淀出纯RNA从植物中提取RNA时，应在匀浆后离心，并加 上以上操作步骤。