生物技术制药 及 名词解释文档格式.docx

1、核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型细菌菌株制备质粒DNA。 酶切反应的温度 DNA的分子结构 反应缓冲液组成 反应时间、反应体积等 工具酶 核酸限制性内切酶：识别、水解外源的双链DNA分子上特定的核苷酸序列。主要存在于原核微生物中。 同裂酶：指来源不同，识别序列相同的酶；进行同样的切割，产生相同的末端 同尾酶：来源不同，识别序列不同，但产生相同的粘性末端DNA甲基化酶：具有宿主专一性，对宿主自身DNA上特定核苷酸进行甲基化修饰，避免被自身限制性内切酶水解 DNA连接酶 T4噬菌体连接酶：连接双链DNA切口，或带粘性末端或平头末端的DNA片段 大肠杆菌

2、DNA连接酶：连接双链DNA切口，或带粘性末端的DNA片，不能连接带平头末端的DNA片段 聚合酶：以DNA或RNA为模板，将核苷酸连续加至3-OH末端，合成方向为53。DNA聚合酶、RNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶：53DNA聚合酶活性；53DNA外切酶活性；35DNA外切酶活性；RNA H酶活性 Klenow酶：不具备53DNA外切酶活性 T4噬菌体DNA聚合酶：不具备53DNA外切酶活性。外切酶活性比Klenow酶强200倍，对单链DNA作用强于双链DNA T7噬菌体DNA聚合酶： Taq DNA聚合酶 反转录酶：催化以RNA或DNA为模板，合成DNA；具有RNA H酶的活性 末端脱氧核

3、苷酸转移酶：催化dNTP沿53聚合，逐个加于线性DNA分子的3末端；不需要模板 载体：（vector）来源于质粒、噬菌体或病毒的DNA分子，可供插入或克隆目的基因或DNA，并具有运载外源DNA导入宿主细胞的能力。 质粒载体：共价闭合环状DNA（cccDNA）；开环DNA（ocDNA）；线状DNA（lDNA） 质粒的三个重要性质：遗传传递的能力；遗传交换的能力；不相容性 用于克隆的质粒的三个要素：复制子、选择标记、多克隆位点 常用质粒载体：克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体 噬菌体载体：插入型载体、置换载体 来源于噬菌体DNA，因可以插入较大DNA片段，常用于构建基因组文库和cDNA文库。

4、目的基因的常用制备方法 化学合成法：前提：基因的DNA的序列已知。小于100bp的片段：直接合成，最常用固相亚磷酸三酯法。 大片段目的基因：小片段粘接法、大片段酶促法 PCR法：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。 基因文库法：鸟枪法：适用于原核细菌目的基因的克隆分离 cDNA文库法（与mRNA互补的DNA）并非所有的mRNA分子都具有polyA结构；仅限于克隆蛋白质编码基因；mRNA含量少且t1/2短，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难第一链：mRNA模板，引物 （polyT） ，逆转录酶，dNTPs第二链：自身引导法：取得的双链cDNA5端会有几对

5、碱基缺失（NaOH，煮沸；Klenow酶，dNTPs；S1内切酶）引导合成法：获得的cDNA能保持完整的5端序列（TdT, Dctp；NaOH；退火；Klenow酶，dNTPs） 基因文库的完备性：指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N= ln（1P） /ln（1f），P=完备性，f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小 双酶切产生的粘性末端，最常用，可以确保连接方向的正确性 影响连接效率的因素：连接方式；目的基因与载体的浓度比例摩尔数比大于1；连接温度、时间、酶的活性、反应缓冲体系 重组DNA导入宿主细胞 导入大肠杆菌：CaCl2法；转

6、染法 导入酵母：电转化法；化学转化法；原生质转化法 导入链霉菌：原生质转化法；电穿孔法 重组DNA导入哺乳动物细胞：显微注射法；DEAE葡聚糖转染法；DNA-磷酸钙转染法；阳性脂质体介导法；电穿孔法；细胞融合法；病毒感染法 重组子的筛选与鉴定 遗传标记筛选法：抗生素抗性筛选法；互补筛选法（蓝白斑筛选载体含有LacZ基因，X-gal培养基，成功导入的菌落显示为蓝斑）；营养缺陷型筛选法；噬菌斑筛选法 核酸分子杂交法：菌落原位杂交法；DNA印迹法；RNA印迹法 限制性内切酶图谱法：琼脂糖凝胶电泳鉴定各片段分子量，含有目的基因的为阳性克隆 DNA序列测定法 目的基因表达产物测定法原核细胞表达的特点及选

7、择 大肠杆菌（首选,遗传背景研究清楚；适合大规模生产（成本低，周期短，效率高，操作简单）、芽孢杆菌、链霉菌等 缺点：缺乏翻译后修饰系统；容易以包涵体形式存在；外源蛋白容易被宿主酶系统水解 外源基因表达的调控原件：复制子、启动子（表达效率的关键因素）和终止子、核糖体结合位点（即SD序列及SD序列到起始密码子AUG的距离）、识别翻译后修饰信号 用于原核表达的载体必须具备的条件：具有复制子、灵活的克隆位点和方便的选择标记、很强的启动子、阻遏子（一般有）、强的终止子，所产生的mRNA应具有翻译起始信号（起始密码子AUG以及SD序列） 外源基因在大肠杆菌中的表达方式 胞内表达：非融合蛋白表达：蛋白质接近

8、天然状态，易被降解，易形成包涵体。有原核多肽基因融合蛋白表达：表达效率高；产物稳定；可以切除原核多肽，获得天然外源蛋白 分泌表达：有信号肽基因，形成周质表达或细胞外表达 外源蛋白表达效率的影响因素 外源基因密码子：大肠杆菌具有偏好密码子和稀有密码子，外源基因应尽量设计成为大肠杆菌的偏好密码子 mRNA的结构：改变一级结构；降低5端二级结构稳定性；调控3端非翻译区二级结构 表达载体的选择：表达方式；强的复制子（拷贝数高）；强的启动子（转录效率高）；高效率的核糖体结合位点；强的终止子（提高mRNA稳定性）；适应范围广；稳定性高；产物易纯化。 外源蛋白的稳定性：采用融合蛋白形式表达；采用蛋白酶缺陷的

9、突变菌株真核细胞表达的特点及选择 常用的真核表达系统：酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统大肠杆菌和酵母表达系统的比较大肠杆菌巴斯德毕赤酵母载体原核载体穿梭载体调控序列原核原核和真核表达形式包涵体、融合蛋白、分泌分泌翻译后修饰基本无有生产方式发酵，操作简单、经济发酵，操作较简单、较经济 酵母表达体系的影响因素 外源基因的结构 外源基因5端非翻译区的序列和长度影响mRNA的翻译效率 起始密码子两侧若容易形成RNA二级结构，将阻止翻译进行 富含A-T序列导致转录提前终止 密码子的偏好性 高度复杂的胱氨酸结构基序影响表达效率 表达形式及信号肽的选择：无信号肽常胞内表达；有信号肽，胞外

10、分泌型表达 启动子：多数毕赤酵母采用乙醇氧化酶AOX1、AOX2启动子 转化子的拷贝数：拷贝数越高，表达水平也越高 诱导条件：甲醇诱导的浓度、时间以及温度的选择 外源蛋白的降解：采用酶缺陷型宿主、加入底物蛋白或调节pH值抑制蛋白酶活性，提高外源蛋白的稳定性。 哺乳动物细胞表达系统 表达载体：病毒载体（腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒等）；质粒载体 表达方式：瞬时表达、稳定表达、诱导表达 基因重组蛋白的主要分离技术：离心、沉淀（等电点沉淀法、盐析法）、膜分离、双水相萃取 基因重组蛋白的主要纯化技术：离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析、反相色谱和疏水色谱 选择分离纯化方法的依据 根据表达形式选择

11、分泌型：沉淀和超滤 周质表达：溶菌酶处理渗透压休克 胞内可溶表达：亲和层析或离子交换层析 胞内不溶表达（包涵体）：易与杂蛋白分开，但需要复性形成有活性的蛋白质。 根据分离单元之间的衔接选择 先采用低分辨、分离规模大的方法，后采用高分辨的方法，最后采用分离规模小、速度慢的方法。合理选择色谱分离次序 根据分离纯化工艺的要求选择 具有良好的稳定性、重复性和较高的安全性；尽量较少组成工艺步骤；所用时间尽可能短；工艺和技术必须高效 基因工程药物的质量控制与小分子药物质量控制相比，不同的方面 Mr远大于小分子化学物质，致使适用于小分子药物的鉴别方法无法用于基因工程药物。如质谱 基因工程药物结构复杂，常需多

12、种检测方法 两者杂质性质差别较大。小分子药物杂质主要来源于合成中原料残留、合成副产物和纯化中溶剂残留；基因工程药物多为宿主蛋白残留和宿主基因残留，其检测一般都用专用的试剂盒。 药物定量方面，基因工程药物一般采用生化反应的方式 基因工程药物的质量控制1、蛋白质含量的测定 紫外吸收光谱：在280nm有最大吸收值。快速，无破坏性。不是严格定量，核酸可引起强干扰作用。 BCA法：碱性条件与Cu2络合同时将Cu 2还原成Cu（双缩脲反应），再与二辛可宁酸形成紫色复合物，在562nm有最大吸收值。需短时间10min内完成 Lowry法：碱性条件蛋白质与铜形成复合物可还原磷钼酸磷钨酸试剂，产生深蓝色。特点：

13、灵敏，准确度高；操作步骤多，繁琐；影响因素多（盐酸胍、尿素、EDTA等） 考马斯亮蓝法：灵敏，操作简单，重复性好；抗干扰能力弱 SDS-凝胶染色与扫描分析法2、蛋白质纯度的测定：电泳（SDS-PAGE）、质谱法、色谱法、末端氨基酸分析法3、蛋白质分子量的测定：SDS-PAGE、凝胶色谱、质谱法4、蛋白质等电点的测定5、蛋白质序列分析 N末端氨基酸序列分析：鉴定蛋白质的种类；C末端分析：判断表达、纯化过程中有无加工6、蛋白质二硫键分析7、蛋白质活性的测定8、免疫测定法9、内毒素分析、宿主蛋白和核酸残留分析基因工程药物的实例：干扰素（IFN）、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（CMCSF）、人白细胞介

14、素-2（IL-2）、胰岛素、人生长激素（hGH）第三章 动物细胞工程制药动物细胞的体外培养 体外培养动物细胞的形态：贴壁依赖性细胞，非贴壁依赖性细胞，兼性贴壁细胞 贴壁依赖性细胞：成纤维样细胞型（主要来源于中胚层组织）；上皮样细胞型（主要来源于外胚层和内胚层组织） 非贴壁依赖性细胞：又叫悬浮细胞，一般呈圆球形。主要来源于血液、淋巴组织、杂交瘤细胞 兼性贴壁细胞：如CHO细胞、小鼠L929细胞动物细胞的生理特点1） 细胞的分裂周期长，一般为1248h（G1 S G2 M）2） 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象3） 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的4） 动物细胞对周围环境十分敏感（如渗透压、

15、pH、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化耐受力很弱）5） 动物细胞对培养基的要求高（需要12种必需氨基酸、8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为主要碳源的葡萄糖，以及多种细胞生长因子和贴附因子，而且不同种类要求又有变化。）6） 动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同培养条件要求高、成本贵，产量低；多半是分泌在胞外的，收集纯化方便，得到了较完善的翻译后修饰 动物细胞培养的条件（一）环境条件： 直接接触的器材、防止污染（显著地污染标志：pH值迅速改变，细胞外形模糊，甚至出现细胞集落）、水质、pH（大多是7.2-7.4）、渗透压、温度、通氧量、基本营养物质（二）营养要求：水、碳源、氮源

16、、维生素、激素、无机盐等 碳源不能为无机物，大多只能利用葡萄糖 氮源不能为无机物，主要利用各种氨基酸 在多数情况下，需要添加520的小牛血清，或适量动物胚胎浸出液。培养基：天然培养基，合成培养基，无血清培养基 天然培养基：主要见于早期阶段，来源：血浆凝块、淋巴液、血清（最常用有效）、羊水、腹水等。分维持液（低或不含牛血清）和生长液（5%-20%牛血清） 合成培养基：主要成分：糖、氨基酸、核苷酸前体、维生素、激素、缓冲体系、无机盐等 无血清培养基提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批之间差异的影响；减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；供应充足、稳定；细胞产品容易纯化；避免

17、了血清中某些因素对有些细胞的毒性；减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析血清的作用：提供各种生长因子和激素，贴附因子和伸展因子，可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白，必须的脂肪酸和微量元素 其他常用溶液：平衡盐溶液；培养基pH调整液；细胞消化液（胰蛋白酶，EDTA）；抗生素溶液动物细胞培养的基本技术和方法 动物细胞培养的方法：原代培养、传代培养、克隆培养 细胞的原代培养：组织块培养法、单层细胞培养法。取动物组织块剪碎分散处理（加胰蛋白酶或胶原蛋白和EDTA）洗涤纯化计数稀释培养 细胞的传代培养：离心或酶消化法收获细胞，计数后，以适当浓度接种到新的培养环境中 单克隆培养动物

18、细胞培养的基本技术：细胞分离（离心法；蛋白酶消化法）；细胞计数；细胞传代；细胞的冻存（慢冻，液氮,196度） 和复苏（快融，投入37水浴融化） 冻存主要步骤：活性好的细胞，加保护剂（DMSO等）混合；做好标记（细胞种类、日期等）；逐渐降低温度，最后放至液氮中；降温梯度要合适，总的原则是慢冻生产用动物细胞 原代细胞：费钱费力，少用 传代细胞系：安全，特点： 2n核型，贴壁依赖，接触抑制，有限传代（50代） 转化细胞系：自发转化或人为转化，失去了正常细胞的特点，可=无限增殖传代，适宜大规模工业培养 工程细胞系：融合细胞系（仙台病毒融合法、聚乙二醇融合法、电融合法）；基因工程细胞系 病毒载体：牛痘病

19、毒。腺病毒和逆转录病毒载体，杆状病毒载体-昆虫细胞系统 基因工程细胞主要的筛选系统，HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择系统，筛选tk+、hgprt+的转化细胞GPT（HAT、黄嘌呤、甘氨酸、霉酚酸）选择系统，筛选gpt+的转化细胞 G418（Geneticin）选择系统，筛选Neor的转化细胞MTX选择系统，筛选dhfr+的转化细胞细胞库的建立：原始细胞库（MCR）生产用细胞库（MWCR，又称工作细胞库，主细胞库生产细胞库）常用生产用动物细胞：BHK-21，C127细胞，CHO-K1，COS细胞，MDCK细胞，WI-38，MRC-5，Namalwa，Sf-9，Vero，SP2/0-Ag

20、14动物细胞大规模培养 动物细胞的大规模培养方法 悬浮培养：适用于非贴壁依赖细胞或兼性贴壁细胞优点：操作简便，培养条件均一，传质传氧较好，容易扩大培养，可以借鉴细菌培养的经验。缺点：细胞培养密度较低。 微载体培养：用于培养贴壁细胞。充分发挥悬浮培养的一切优点。理想的微载体应具备：生物相容性、无毒性、表面惰性、比重适当（1.030 1.045g/ml）、粒径均一，在60250m之间（溶胀后）、光学透明、柔软、耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料充分 多孔载体培养：可用于悬浮细胞及贴壁细胞。细胞在网格内，能避免受到剪切力的损伤，因此培养体系可以提高搅拌速度和通气量。多孔载体的一般条件：具备

21、生物相容性、机械稳定性和热稳定性 微囊化培养：避免剪切力对细胞造成的损伤；获得较高细胞密度107108个/ml；利于纯化；可采用多种生物反应器进行培养 中空纤维培养：把细胞接种在中空纤维的外腔，利用中空纤维模拟毛细血管提供营养。理想的动物生物反应器必须具备的基本要求：1 体系中的各种材料，对细胞必须无毒性。2 生物反应器结构的传质、传热和混合性能好。3 密封性能良好，可避免一切外来微生物的污染。4 培养环境多种物化参数可自动检测和调节控制，控制的精确度高，且能保持环境质量的均一。5 可长期连续运转，尤其对于动物细胞而言。6 容器加工制造时要求内面光滑，无死角。7 拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸

22、汽消毒便于操作消毒。8 设备成本尽可能低。 动物细胞生物反应器 规模：实验室规模：100L 类型：搅拌罐式；气升式；中空纤维式；透析袋或膜式；固定或流化床式；一次性摇袋式细胞培养 主要操作方式： 分批式操作：能够控制的参数只有PH、温度和通气量 补料-分批（或流加式）操作：不断地向系统中补充新的营养成分 半连续式操作 连续式操作和灌流式操作：后者取出部分条件培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，而连续式培养则同时也取出了部分细胞。转基因动物 基本原理及步骤：外源目的基因的制备外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞选择获得携有目的基因的细胞选择合适的体外培养系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及

23、鉴定筛选所得的转基因动物品系转基因动物制作方法 经典的技术路线：基因显微注射法，最常用、成功的方法，成功率低 整合胚胎移植的技术路线：受精卵的成活率高达90以上，外源基因整合率高，提高受孕率 核移植（克隆）的技术路线：体细胞核移植；核移植前导入目的基因。 整合卵受精的技术路线：卵母细胞导入目的基因后再与精子受精。 具体方法：基因显微注射法、反转录病毒感染法、胚胎干细胞方法，精子载体导入法、基因打靶法、人工酵母染色体法 转基因动物研究出现的问题：制作转基因动物效率低；外源基因在宿主基因组中的行为难以控制；转基因表达水平低转基因动物反应器：（bioreactor）目的片段在器官或组织中表达的转基因

24、动物。如乳腺、膀胱、血液等动物细胞产品制造实例：类淋巴细胞干扰素、组织型纤溶酶原激活剂、单链尿性纤溶酶原激活剂-尿激酶原、促红细胞生成素（EPO）、凝血因子VIII、乙型肝炎疫苗第四章 抗体工程制药概述 抗体工程应用于医学领域：研究，以免疫转印法检测特定抗原；医疗，以毒素连结抗体攻击 病变細胞；检验，以 ELISA侦测特定病原体；多克隆抗体（polyclonal antibody，pAb）简称多抗。如:免疫血清（含多种特异性抗体）实际意义：预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清（抗破伤风）；胎盘球蛋白（抗病毒感染）。副作用：超敏反应。 临床诊断，如：肥达氏反应（伤寒、副伤寒）。特异性差单克

25、隆抗体（monoclonal antibody, mAb ）简称单抗 优势：特异性高：只识别某一个特定的抗原决定簇。 均一性好：其H链、L链及V区独特性其完全一致，所得到的抗体结构和生物学性状完全一致。杂交瘤细胞：既能产生单一抗体，又能无限增殖抗体分子的结构和功能 基本结构: 四肽链结构 重链（H链）和轻链（L链）天然Ig分子中，重链同类，轻链同型。重链可分为五类：、链IgM、IgG、IgA、IgD、IgE；轻链可分为、型。 可变区（V区）、恒定区（C区）和铰链区（木瓜蛋白酶、胃蛋白酶） VL 、VH区各有3个超变区（也称互补决定区，CDR1-3），共同组成Ig的抗原识别部位，形成与抗原决定簇

26、互补的表位。可变区中的其它部分变化较小，称为骨架区（FR） C区决定Ig分子的异种抗原性，主要发挥抗体分子的效应功能。 抗体分子的价位：指抗体分子能结合的抗原表位数的多少。VH和VL的CDR区共同构成抗原的结合位点，因此一个单体免疫球蛋白分子有两个抗原结合点，故习惯将单体抗体分子称为2价分子。单克隆抗体的制备 产生杂交瘤细胞的三个关键点：B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的特性、细胞融合技术、杂交瘤细胞的筛选单克隆抗体制备的基本过程（理解）：抗体与动物免疫，提取能够产生抗体的B淋巴细胞，B淋巴细胞与小鼠的骨髓瘤细胞在灭活的仙台病毒/聚乙二醇的诱导下融合，并在特定的选择培养基下筛选出杂交瘤细胞。在体外条件下

27、做大规模培养/注射到小鼠腹腔内增殖。再提取出大量的单克隆抗体,最后进行纯化。 抗原和免疫：抗原的制备（通常和佐剂混合，增强免疫应答）、免疫动物（体内/体外免疫方法；动物的选择：一般采用与骨髓瘤供体细胞同一品系的动物） 细胞的融合和杂交瘤细胞的筛选 细胞的融合：制备脾细胞悬液：最后一次免疫后三天，1108个； 制备骨髓瘤细胞悬液：对数生长期细胞，（23）107个； 融合：4050PEG（MW4000），37，5min HAT培养基筛选杂交瘤细胞HAT培养基筛选原理：H（次黄嘌呤）；A（氨基蝶呤）；T（胸腺嘧啶）。骨髓瘤细胞不具备HGPRT和 TK，B淋巴细胞寿命短。 影响细胞DNA的合成：H促进了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）途径； T促进了胸