完整版东北红豆杉枝叶中有效成分空间分布及生长时期变化规律毕业论文文档格式.docx

1、时间安排：2008年11月-2008年12月 查找相关文献，搜集相关资料2009年3月-2009年4月 完成实验部分2009年4月-2009年5月 整理实验数据2009年5月-2009年6月 撰写毕业论文完成工作量与水平要求：在规定时间内完成实验内容规定的所有项目，达到国家统一要求的学士学位论文水平其中，参考文献篇数：20篇以上（其中外文文献3篇以上） 论文字数： 10000字以上 专业负责人意见签名： 年 月 日摘 要东北红豆杉（Taxus cuspidata Sieb. et. Zucc.）是红豆杉科（Taxaceae）红豆杉属植物，是我国东北分布的珍贵第三纪孑遗树种、国家I级重点保护的野

2、生濒危植物种类。紫杉醇（paclitaxel，商品名taxol）及三尖杉宁碱（cephalomannine）均为红豆杉属植物中含有的二萜类化合物，具广谱抗肿瘤活性和独特的抗癌作用机理。本实验探讨了不同部位、不同生长时期东北红豆杉枝叶中的紫杉醇和三尖杉宁碱含量的分布规律，结果表明多数树冠部位的当年生枝叶中两种物质的含量低于两年生和三年生枝叶，而两年生和三年生枝叶中两种物质含量差异不显著；阳面树冠的3个层次的两种物质含量无明显差异，阳面的含量稍高于阴面。天然东北红豆杉当年生枝叶中紫杉醇含量在休眠期达到最高，花期和果期含量无太大差异；三尖杉宁碱含量在休眠期也最高，部分植株的当年生枝叶中三尖杉宁碱含量

3、为花期低于果期，但有个别植株中二者含量差异不显著；每个植株个体之间紫杉醇和三尖杉宁碱含量均差异显著。关键词：东北红豆杉；紫杉醇；三尖杉宁碱；超声提取；HPLCVariation in Paclitaxel and Cephalomannine contents in nature Japanese yewAbstract The Japanese yew （Taxus cuspidata Sieb. et. Zucc.） is a survivor tertiary species and national level endangered species which belongs to T

4、axaceae. Paclitaxel and cephalomannine are both diterpenoid in Taxus with special anticancer mechanism and antitumous activity.This experiment branches and leaves of Japanese yew in different parts and periods. The results indicated that most parts of paclitaxel and cephalomannine contents in branch

5、es and leaves of current year were lower than those of biennial and perennial, but paclitaxel and cephalomannine contents in branches and leaves biennial and perennial; there were no conspicuous difference in three sunny side were slightly the overcast side. Paclitaxel contents of current branches a

6、nd leaves were flower season and fruit season. The contents of cephalomannine was flower season were lower than fruit season of parts of samples trees, but some was significant.Key words：Taxus cuspidata；paclitaxel；cephalomannine；ultrasonic extraction method；目 录摘要1 绪论 11.1 植物次生代谢 11.2 东北红豆杉 11.2.1 东北

7、红豆杉生物学特征 11.2.2 东北红豆杉资源的利用价值 21.2.3 东北红豆杉资源及现状 21.3 紫杉醇和三尖杉宁碱 31.3.1 东北红豆杉枝叶中的化学成分 31.3.2 紫杉醇 31.3.3 三尖杉宁碱 41.3.4 研究进展 51.4 立题依据 62 实验材料及方法 72.1 实验材料 72.2 仪器与试剂 72.2.1仪器. .72.2.2试剂 72.3 实验方法 72.3.1 样品制备 72.3.2 色谱条件 82.3.3 标准溶液配制 82.3.4 标准曲线绘制 83 结果与分析 93.1 天然东北红豆杉不同树冠部位枝叶中紫杉醇及三尖杉宁碱的含量 93.1.1 天然东北红豆杉

8、不同树冠部位叶中紫杉醇及三尖杉宁碱的含量 93.1.2 天然东北红豆杉不同树冠部位枝中紫杉醇及三尖杉宁碱的含量 103.2 天然东北红豆杉当年生枝叶中紫杉醇及三尖杉宁碱含量的生长时期变化规律 103.2.1 当年生叶中紫杉醇及三尖杉宁碱含量的生长时期变化规律 103.2.2 当年生枝中紫杉醇及三尖杉宁碱含量的生长时期变化规律 124 讨论 144.1 天然东北红豆杉不同树冠部位枝叶中紫杉醇及三尖杉宁碱的含量 144.2 天然东北红豆杉当年生枝叶中紫杉醇及三尖杉宁碱含量的生长时期变化规律 145 结论 15参考文献致谢不同部位和季节东北红豆杉枝叶中有效成分含量变化1 绪论1.1 植物次生代谢植物

9、的次生代谢（plant secondary metabolism）是相对于初生代谢而言的，这个概念最早是由Kossel于1891年明确提出的1。绿色植物及藻类因为有叶绿素，可以通过光合作用将二氧化碳和水转化成糖类，并放出氧气，生成的糖则进一步通过不同途径（如磷酸戊糖途径，糖酵解途径，三羧酸循环），产生核酸合成的原料如核糖等，脂类合成的原料如丙二酸单酰辅酶A（malmyl CoA）等，并通过固氮反应得到一系列的氨基酸（合成肽和蛋白质的重要原料），此过程因为对维持植物生命活动过程来说是不可缺少的，且几乎存在于所有的绿色植物中，故习惯上称为初生代谢（primary metabolism），相应地糖、

10、蛋白质、脂类和核酸等这些对植物有机体生命活动来说是不可缺少的物质，则称为初生代谢产物（primary metabolites）2。次生代谢产物在植物中的合成与分解过程称为植物次生代谢3。次生代谢产物包括生物碱、糖苷、萜类、甾类、皂苷、多炔类和有机酸等。它在维护植物自身的生存和发展具有重要的作用。我国植物种类繁多，植物资源丰富，对植物次生物质对植物自身作用的研究，除学术价值外，对这些次生物质的进一步开发利用也极具启发指导意义4。1.2 东北红豆杉东北红豆杉（Taxus cuspidata Sieb. et. Zucc.）是红豆杉科（Taxaceae）红豆杉属植物，又名紫杉、赤柏松，是我国东北分布

11、的珍贵第三纪孑遗树种、国家I级重点保护的野生濒危植物种类5，起源于古老的第三纪，曾广泛分布于北半球，第四纪冰川时期其分布范围大大缩小。亿万年来，地质构造的运动和地势地形的变化，使一部分红豆杉在特殊的环境中得以保留下来，形成了明显的地理种群隔离。由于红豆杉种群竞争力弱、天然更新缓慢和地理分布局限等客观因素，导致红豆杉属植物早在20世纪80年代就被列入国家级保护植物。90年代以来，随着抗癌新药紫杉醇的开发利用，红豆杉原料供需矛盾日益突出，人类掠夺式的生产经营活动，加剧了其濒危程度，1999年我国将红豆杉属物种列入级保护植物。红豆杉被称为植物王国里的“活化石”，是世界珍稀树种6。1.2.1 东北红豆

12、杉生物学特征东北红豆杉为常绿乔木，高1017 m，胸径1013 cm，树冠倒卵形或宽卵形，大枝平展。树皮红褐色或灰红褐色，片状剥裂。叶条形，有短柄，生于主枝上者为螺旋状排列，生于侧枝上者叶柄基部左右扭转，成不规则羽状排列，约成45角斜展，柔软，先端凸尖，基部渐狭，上面光绿色，下面灰绿色，两面中脉隆起，背面有两条灰绿色气孔带，长1.52.5 cm，宽2 mm左右。枝互生，幼时深绿色，老时红褐色。雌雄异株；球花单生于前年枝的叶腋；雄蕊614枚，集生成头状，花药58裂，淡黄色；雌花具1胚珠，卵形淡红色。种子坚果状，卵圆形稍扁，有23条棱线，红褐色，有光泽；假种皮杯形，淡红色。肉质，富浆汁，基部有数对

13、黄色鳞片。花期56月，果期78月，种子9月成熟7-9。东北红豆杉性喜凉爽湿润气候，幼树时喜荫庇，78年后喜光，抗寒性强，可耐-30以下的低温，最适温度2025，属阴性树种。喜湿润，怕涝，适于疏松、微酸性、湿润（土壤含水率40%60%）、排水良好的砂质土壤，忌积水和沼泽地。种子发芽后幼苗生长较慢。4月中旬芽开始膨大，4月下旬为芽的开放期，5月上、中旬为新芽展叶期，老叶脱落更新多在56月10。1.2.2 东北红豆杉资源的利用价值1.2.2.1 药用价值东北红豆杉提取物中的主要化学成分具有多种药用价值，其中紫杉醇等紫杉烷二萜类次生代谢产物具有独特机理的抗癌作用，被认为是癌症治疗的重大进展之一，对食道

14、癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌7、鼻咽癌、膀胱癌、前列腺癌及急性白血病有特殊的防治效果，特别是对晚期卵巢癌和转移性乳腺癌治愈率达33%，总有效率在75%以上9，对大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、非小细胞肺癌、头颈部口腔癌11也有一定疗效，据报道紫杉醇还可用于治疗若干种慢性炎症性疾病，其中包括继发性进行性多发性硬化症、风湿性关节炎以及外用治疗牛皮癣和特应性湿疹等12。除此之外，有报道证明红豆杉属植物具有利尿、通经、降血糖、降血压、杀虫止痒的作用，对糖尿病、肾病、风湿病、肠胃病、糖尿病等有独特疗效13。1.2.2.2 重要的用材树种东北红豆杉木材纹理均匀，材质致密芳香，韧性强，坚硬，弹性大，具

15、光泽，耐蚀性强，比重约0.510.76，是著名的上等工业用材和家具用材，力学性质测试表现其干燥时不翘不裂。可供雕刻、制作玩具、文具、船桨及美术工艺品等细加工制品用14,15。1.2.2.3 绿化树种红豆杉属植物树型端正优美，枝叶茂密，叶片常年翠绿，种子生于肉质红色假种皮中，酷似红豆，鲜红夺目，点缀在绿叶丛中令人陶醉。可在植物园、公园、风景区、自然保护区、居住环境区等绿地广泛种植，可孤植或群植，又可植为绿篱，适合于修剪为各种雕塑物式样。由于其生长缓慢，枝叶繁多而不易枯疏，故剪后可较长期保持一定形状，应用矮化技术处理的东北红豆杉盆景造型古朴典雅，枝叶紧凑而不密集，舒展而不松散，红茎、红枝、绿叶、红

16、豆使其具有观茎、观枝、观叶、观果的多重观赏价值。而且红豆杉既耐寒、常绿，又有极强的耐荫性，所以是高纬度地区园林绿化的良好材料10,14。1.2.2.4 其他利用价值东北红豆杉果食成熟后味蜜甜，可直接食用或开发罐头等绿色食用产品，其果实有驱蛔虫、消积食等药用效果。其种子可榨油，心材可生产一种燃料14。综上，东北红豆杉不仅仅具有很高的药用价值，可应用于多种癌症临床的治疗，而且具有一定的经济价值、生态价值、社会价值及文化价值。1.2.3 东北红豆杉资源及现状东北红豆杉的自然地理分布区大致可分为欧亚陆块主体和邻近各岛屿两个部分，其大致的地理范围为：123155E，323053N，垂直分布于海拔2501

17、200 m之间。欧亚陆块主体分布区主要包括：中国东北，朝鲜北部，俄罗斯阿穆尔边疆；邻近岛屿分布区包括：俄罗斯萨哈林岛、日本岛和朝鲜济州岛等16。我国东北红豆杉多生于红松、鱼鳞云杉、白桦、紫椴和山杨等为主的针阔混交林内，分布海拔6001200 m，主产于吉林省长白山区，即吉林安图、汪清、和龙、抚松、浑江、长白及通化地区。向南延伸至辽宁省东部山区的宽甸、桓仁、凤城和岫岩等地。向北延伸至黑龙江省张广才岭东南部，老爷岭山区，小兴安岭南部的宁安、东宁、鸡西、绥棱等地8。其自然地理区域位于千山山脉走向线及其东南侧，长白山山脉走向线及其东南侧，经老爷岭至小兴安岭南端与产于我国的本属其他种类构成间断分布形式1

18、7。目前，东北红豆杉资源严重不足，可利用的野生资源十分有限，人工繁殖栽培的技术也有限，相当一部分人缺乏必要的扦插繁育技术，盲目扦插，不仅导致繁育失败，而且造成了野生资源的浪费，使东北红豆杉野生资源日趋濒危，难于满足生产需要。我国的红豆杉资源开发研究起步较晚，研究力量弱也很分散，设备不足、资金短缺。综上，由于其特殊的繁殖生物学和生态学特性、种群结构不合理及原生生境破坏较严重，致使东北红豆杉种群处于濒危状态，因此，在对其进行研究、开发、利用的同时，应着力加强保护。保护的措施包括：严禁盗采盗伐东北红豆杉；对天然种群分布相对集中的区域应建立围栏进行封育管理；对东北红豆杉母树集中的区域进行适当的林下植被

19、清理，增加天然下种的机会等16。1.3 紫杉醇和三尖杉宁碱1.3.1 东北红豆杉枝叶中的化学成分到目前为止，从东北红豆杉枝叶中分离得到了紫杉烷类二萜化合物、倍半萜类化合物、甾体类化合物、木脂素类化合物、黄酮类化合物、糖苷类化合物及其它类化合物等多种成分18，多数物质是通过植物次生代谢途径而生成，其中最重要的成分是紫杉醇和三尖杉宁碱。1.3.2 紫杉醇紫杉醇是二萜类化合物，其化学名为：5，20-环氧-1，2，4，7，10，13-六羟基紫杉-11-烯-9-酮-4，10-双乙酸酯-2-苯甲酸酯13-酯-（2R,3S）-N-苯甲酰基-3-苯基异丝氨酸，其分子式为C47H51O14N，相对分子质量为85

20、3.9，熔点，具有高度亲脂性，不溶于水19，外观为白色结晶或无定型粉末，其结构如图1-120。图1-1 紫杉醇的化学结构早在1856年，Lucas H就从欧洲红豆杉（Taxus baccata）叶片中提取到粉末状碱性组分，即紫杉碱（taxine）21。1958年，美国国家癌症研究所（NCI）组织化学、生态、药理及临床方面的专家对35000种植物提取物进行抗癌活性的筛选工作。1963年，参加NCI筛选目的Research Triangle Institue的化学家M. E. Wall和M. C. Wani首次从红豆杉树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。在筛选试验中，Wani和Wall发现紫杉醇粗

21、提物对离体培养的鼠肿瘤细胞（包括L1210和P388白血病、Walker256肉瘤癌、肉瘤180以及B16黑色素瘤细胞）有很高活性。他们开始分离这种活性成分，但是由于该活性成分在树中含量极低，分离工作花了他们数年时间，直到1971年，他们才同Duke大学的化学教授Andrew T. McPhail一起，通过X-射线分析确定了该活性成分的化学结构，并把它命名紫杉醇（taxol）22。1982年紫杉醇开始在临床上进行试验，1989年完成期临床，1990年进行期临床，1992年12月29日美国FDA正式批准用于晚期卵巢癌、肺癌、子宫癌的治疗。它是经FDA认证，目前最好的天然抗癌药物之一，是治卵巢癌、

22、乳腺癌的首选药物，对白血病、肺癌、脑癌、直肠癌等疗效也显著，并且毒性试验表明它的毒副作用很小。总之，紫杉醇是一种有效治疗多种癌症的天然植物提取物，其独特的抗癌机制使之成为全球抗癌药物研究热点。2003年全球紫杉醇销售额已经超过20亿美元，并且还在以每年20 %的速度递增23。近年来，国内外的研究人员又从不同角度对紫杉醇抗癌机理、临床应用等方面开展研究24。对于紫杉醇的作用机制，目前普遍认同四种机制，第一，紫杉醇与微管中蛋白N端第31位氨基酸和第217231位氨基酸结合，促进微管蛋白聚合、微管装配，防止解聚，使微管稳定。导致细胞在有丝分裂时不能形成纺锤体和纺锤丝，抑制了细胞分裂和增殖，使癌细胞停

23、止在G2期和M期，直至死亡，进而起到抗癌作用25。第二，紫杉醇可以调节体内的免疫功能，通过作用于巨噬细胞，导致癌坏死因子（TNF-）受体的减少以及（TNF-）的释放，还可促进白细胞介素-1（IL-1）及干扰素（IFN-、IFN-）的释放，对癌细胞起杀伤或抑制作用26。第三，紫杉醇可作用于细胞凋亡受体途径的FasFasl通路，或激活半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族（cysteinyl aspartate proteases caspases）诱导细胞凋亡27。第四，紫杉醇可抑制肿瘤细胞迁移。用紫杉醇处理过的鼠成纤维细胞只能产生扁平足状突起和丝状假足，不能移动11。随着对紫杉醇的需求越来越大，紫杉醇的

24、来源问题一直受到人们的关注。到目前为止，扩大其来源的方法主要包括筛选高产红豆杉栽培品种、化学合成、改进提取工艺、加强天然林保护、代谢调节、基因工程、细胞培养、真菌发酵、寻找紫杉醇类似物、寻找红豆杉替代植物等，这些方面都有相关的科研人员开展了研究工作。1.3.3 三尖杉宁碱三尖杉宁碱（cephalomanine）是最难与紫杉醇分离的一种伴生物，分子式：C45H53NO14，分子量：831.91，结构式如图1-2所示28。三尖杉宁碱是紫杉醇的紫杉烷类同系物，母核完全相同，只是在侧链部分略有不同，其C-13侧链末端是个双键，而紫杉醇的C-13侧链是苯环，三尖杉宁碱可以经过结构修饰转变为紫杉醇29。它

25、在某些红豆杉植物中含量仅次于紫杉醇，药理实验表明它也具有较强的抗肿瘤活性，将它开发成新的抗肿瘤药或将其转化为紫杉醇是有效地利用植物资源的又一途径30。图1-2 三尖杉宁碱的化学结构1.3.4 研究进展从太平洋红豆杉树皮中分离鉴定出抗癌新药紫杉醇之后，红豆杉资源的开发受到了极大的关注，因其具有防癌、抗癌巨大的药用功能，且被列为世界濒危物种，国家级保护植物，成为征服癌症的“希望之树”，成为价值昂贵的植物黄金。因此，紫杉醇及其他紫杉烷类次生代谢产物含量的影响因素备受关注。Erik等从英国和荷兰的5个不同的地方采集了750个枝叶样本并分析了每个样本中紫杉醇、10-脱酰基紫杉醇、三尖杉宁碱、巴卡丁和10

26、-脱酰基巴卡丁的含量31。结果显示不同物质在不同品种红豆杉中含量差异很大。苏应娟等曾报道过我国粤北连州地区南方红豆杉不同组织中紫杉醇的含量，并且发现与相应T. cuspidata和T. yunnannesis的组织相比含量较高32。郑德勇曾对云南红豆杉、东北红豆杉及南方红豆杉的紫杉醇含量进行考察，结果表明，不同树种的植物原料中紫杉醇含量有一定的差异，其中云南红豆杉样品中紫杉醇含量最高，树木各部位平均含量达1.4910-4（ww），其次为南方红豆杉及东北红豆杉，其树木各部位平均含量分别为1.2510-4（ww）和1.0810-4（ww）33。紫杉醇及其衍生物的含量随季节而变化，不同生长季节叶中的

27、紫杉醇含量的动态变化较大。张鸿等分别于4月、9月随机采集同一地点的红豆杉树皮各l0份，分别进行紫杉醇含量测定。结果显示，采集于4月的红豆杉树皮中紫杉醇含量明显高于采集于9月的样品34。张凤梅的实验结果显示，从3月份气温回升，植物开始萌动生长，东北红豆杉中紫杉醇的含量降低，随着植物光合能力的增强，紫杉醇的含量也增加，7月份的紫杉醇在叶中积累量最大，达到0.02384%。之后东北红豆杉叶中的紫杉醇含量降低趋势，尽管在随后的几个月内紫杉醇含量又逐渐增加，但增加量还是很有限35。储存方法的不同也会导致测定得到的紫杉醇及其衍生物含量不同，Fett的研究表明，叶在冰冻下96h、25下真空96h（均为避光条

28、件）及新鲜提取显示的紫杉醇含量无显著差异，但叶在60、96h，紫外光谱上紫杉醇峰出现变化，表明在此条件下紫杉醇有降解36。ElSohly等的研究证明保存干剪枝有利于紫杉醇的保存37。薛艳华等以东北红豆杉新鲜枝叶为材料，比较不同烘干预处理方法对紫杉醇含量的影响，分别进行了自然风干、烘箱干燥、微波干燥三种不同的干燥方法，通过对干燥时间和紫杉醇含量的综合考虑，最终确定微波干燥法为最佳提取方法38。以上这些因素都或多或少影响红豆杉中次生代谢产物的含量，但由于这些因素并非单独作用，除非采取严格的实验控制否则很难单独考察各个因素的影响。1.4 立题依据东北红豆杉枝叶中某些紫杉烷类物质具有独特的抗癌活性，其

29、中紫杉醇和三尖杉宁碱是具有代表性的两种物质。紫杉醇现已广泛应用于卵巢癌等癌症的临床治疗，三尖杉宁碱虽与紫杉醇相比具有稍弱的抗癌活性，但是仍可以特定过程合成紫杉醇。野生红豆杉资源匮乏严重阻碍了我国药用紫杉醇的产业化发展，对天然东北红豆杉枝叶中两种有效成分含量变化规律的研究，可以指导人们对野生东北红豆杉资源合理、有效、充分的利用。这样不仅为紫杉醇大量生产提供解决途径，又可以避免野生资源遭到毁灭性的破坏。同时，紫杉醇及三尖杉宁碱作为红豆杉植物的次生代谢产物，对其含量变化研究可以从更深的层次揭发植物与环境的内在联系，为全面、深入认识植物与环境的相互关系提供新的研究途径。2 实验材料及方法2.1 实验材

30、料不同树冠部位枝叶：2007年采集于黑龙江穆棱东北红豆杉自然保护区，80下烘干至恒重，然后粉碎干燥保存备用的枝叶样品。不同生长时期枝叶：在黑龙江穆棱东北红豆杉自然保护区中，分别于2008年5月（花期）、2008年9月（果期）、2008年11月（休眠期）对选中的10株成树进行样品采集。采集部位为向阳面下部。所有样品采集后在80下烘干至恒重，然后粉碎干燥保存备用。2.2 仪器与试剂高效液相色谱仪Waters2487型紫外检测器美国WatersWaters1525型进样泵AB104型电子天平瑞士氮吹仪北京八方世纪科技有限公司FW100型粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司AS20500A型超声清洗器天津Auto scienceAllegra 64R高速冷冻离心机美国BeckmannMultitemp型恒温循环水浴美国Amersham biosciences色谱柱：C18柱（250mm4.6mm，5m）美国Thermo Hypersil公司