对乙酰氨基酚对心肌细胞HO损伤保护作用Word格式文档下载.docx

1、中图分类号:Q952.6文献标志码:A文章编号:1674一o424（2008）O30206一o4ProtectiveEffectofAcetaminophenonCulturedCardiacMyocytesJnjuredbyH202ZHONGCaiqin,LIUYi,LVJunjie,HUChanghong（1.DepartmentofPharmacology,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001China;2.DepartmentofOrthopaedics,theFirstAffiliatedHospitalofLiaoningMedicalUn

2、iversity,Jinzhou121001China）Abstract:ObjectiveThepurposeofthisinvestigationwastodeterminetheroleofacetaminophenonculturedneonatalratcar-diacmyoeytesinjuredbyH202.MethodsCulturedneonatalratcardiacmyocyteswerepretreatedwithacetaminophen（20Ixmol-L,6oIxmol?Land180I.tmol?L）for1hbeforetreatedwithH2O2（0.2m

3、mol?L）for6h.TheactivityofdehydrogenaseinmitochondriawasdetectedbyMTTassay.TheactivityofLDH,contentofMDA,activityofSODandcaspase一3weredeterminedbyLDH,MDA,SODandeaspase一3kit.ResultsThedescentoftheactivityofdehydrogenaseinmitochondriadetectedby（Mar）,theincreaseofLDHinculturemedium,theelevationofMDAandt

4、heincreaseactivityofcaspase一3inducedbytreatmentofH2O2weresignificantlyreversedbyacetaminophen.Theeffectofacetaminophenwasincreasedwiththerisingofitsconcentration.ConclusionsAeetaminophencoulddecreasetheinjuryofeardiomyoeytesinducedbyH202,inhibittheapoptosisofeardiomyoeytesinducedbyH2O2,andthiscardio

5、protectiveeffectmayberelatedtotheantioxidantnatureofthedrug.Keywords:acetaminophen;hydrogenperoxide;eardiomyocyte;apoptosis对乙酰氨基酚（acetaminophen,APAP）作为治疗疼痛和发热的主要药物已有50多年的历史了,遗憾的是,关于APAP的研究一直集中在解热镇痛和肝毒性方面,而该药对哺乳动物其它器官（如心脏和循环系统）的作用却被忽略了.直到今天,人们关于APAP对哺乳动物的呼吸,肾脏,内分泌,神经,胃肠道,心血管系统的作用还知之甚少.最近国外研究显示,APAP对哺

6、乳动物心肌有保护作用:APAP对豚鼠离体心脏缺血再灌注损伤有保护作用【】;对在体犬的心肌梗死有保护作用.但其对心肌保护作用的确切机制以及对培养心肌细胞损伤的作用还有待于进一步研究.本实验通过HO引起的培养心肌细胞损伤模型进一步探索APAP在细胞水平对心肌的作用及其机制.1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物出生23d的SpragueDawley（sD）大鼠,雌雄不拘,由辽宁医学院实验动物中心提供.作者简介;钟彩琴（1981）,女,山西省晋城市人,在读硕士研究生,主要研究方向为心血管药理学.通信作者:刘义（1964）,男,辽宁省锦州市人,教授,硕士研究生导师,主要研究方向为心血管药理学.钟彩琴

7、,等:对乙酰氨基酚对心肌细胞H:损伤的保护作用1.1.2主要药品和试剂APAP:Sigma公司,用前溶于DMEM,配成所需浓度,调pH值为7.2;Trypsin（1:250）:Sigma公司;DMEM低糖培养基:Gibco公司;新生牛血清:杭州四季青生物科技有限公司;LDH,MDA,SOD试剂盒:南京建成生物工程研究所;M,rI:培养板:Becton公司.1.1.3主要仪器791磁力加热搅拌器:江南金坛电视大学应用电子厂;OLYMPUS倒置显微镜:日本;800型离心沉淀器:上海手术器械厂;全自动生化分析仪:BECMANCX5PRO;恒温水浴振荡器:江苏金坛中大仪器厂;DG3022A型酶标仪:南

8、京东华电子集团;恒温水浴振荡器:江苏金坛中大仪器厂.1.2方法1.2.1原代心肌细胞培养取出生23d的SD大鼠乳鼠,雌雄不拘.无菌条件下,酒精消毒皮肤,开胸剪取心脏,用DMEM液洗涤3次后,剪成约1mm的小块,加人0.08%胰蛋白酶消化液5mL,在磁力搅拌器上（3537）进行消化.重复以上过程46次,直至将组织块消化,细胞分离完全.以1000r/min离心810rain,吸弃上清液,加人含15%新生牛血清的DMEM培养基（含庆大霉素4万U?L）,混悬沉淀的细胞,以100钼钢网过滤后置人CO孵箱,37静置培养1.52h,以差速贴壁法纯化心肌细胞.将细胞密度调至（510）?mL或（110.）?mL

9、,0.4%台盼蓝染色,活细胞存活率>90%,接种培养板（培养瓶）,送人通以5%CO孵箱.每48h更换1次培养液,培养23d,进行指标测定.1.2.2实验分组将培养48h的细胞分为5组正常对照组:不加任何药物;HO损伤组;20txmol?LAPAP保护组;60txmol?LAPAP保护组;18Otxmol?LAPAP保护组.损伤组在正常心肌细胞培养48h后加人终浓度0.2mmo|?L的HO作用6h;各保护组加人不同浓度的APAP孵育1h后,加人与损伤组相同的处理因素.1.2.3线粒体脱氢酶活性测定原代心肌细胞培养,将细胞密度调至（1mL,接种于96孔培养板,各组分别对应加人处理因素.于测试

10、前4h,每孔加人2OLMTT（MTT终浓度0.5mg?mL）;于cO孵箱中继续培养4h后弃去培养液,每孔加人二甲基亚砜100L,震荡10min,使充分溶解,用酶联检测仪检测各孔OD值（检测波长为570nm）,可间接反映细胞活性的高低.1.2.4心肌细胞SOD,MDA,LDH的测定收集细胞参照试剂盒说明书MDA采用硫代巴比妥显色法测定,SOD采用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶法测定活性.收集培养上清液根据试剂盒说明用全自动生化分析仪测培养介质中LDH活力.1.2.5Caspase一3活性的定量检测收集细胞,每份样本加人5OL细胞裂解液,冰上孵育1Omin,离心（10000r/min,4,5min）,留取上

11、清（其中5L用BCA法作蛋白定量）.吸取含100Ixg蛋白的细胞裂解上清,用细胞裂解液补足至总体积5OL,加5OL反应缓冲液于每一样品管中并加5L底物,37避光4h.用酶标仪在405nm处测定其吸光值,用OD值间接表示caspase一3的活性o1.2.6统计分析实验数据应用SPSS11.5软件包进行统计分析,采用方差分析及LSDt检验进行统计学处理.2结果2.1APAP对心肌细胞活性的影响,OD值大小可间接反映心肌细胞活力高低.分析数据可知HO组比正常对照组细胞活力降低,说明心肌细胞受到损伤;不同浓度APAP组较损伤组细胞活力增加,随浓度增加作用明显.说明APAP能保护HO损伤的心肌细胞,并有

12、剂量依赖性,见表1.表1对乙酰氨基酚对H:02损伤心肌细胞活性（oD值）的影响（s,n:8）组别MTI（OD）正常对照组H2O2损伤组H2O2+APAP20iraol?L一H202+APAP60iraol?LH202+APAP180iraol?注:与正常对照组比较,一P（0.01;与H202损伤组比较,P（0.012.2APAP对培养液中LDH活性,细胞内MDA含量和SOD活性的影响结果显示,与正常对照组比较,H2O2组LDH活性和MDA含量明显高于正常组,SOD活性明显低于正常组,不同浓度APAP组较损伤组LDH活力和MDA含量有所降低,SOD活性有所增加,并随浓度增加效果明显,见表2.7#

13、叭208辽宁医学院2008年6月,29（3）表2对乙酰氮基酚对H2o2损伤心肌细胞LDH活性,MDA含量,SOD活性的影响（i,I=6）与正常对照组比较,一P<O.O1;与H202损伤组比较,P&O.O12.3APAP对H202所致心肌细胞Caspase一3活化的影响Caspase一3活性定量检测结果显示,与正常对照组比较,HO组Caspase一3活性明显高于正常组,不同浓度APAP组较损伤组Caspase一3活性有所降低,并随浓度增加效果明显,见表3.表3对乙酰氮基酚抑制H:所致心肌细胞Caspase-3活化（i,n=6）组别OD值H2o2损伤组H2o2+APAP20ttmol?H20

14、2+APP60ttmol?L一H2o2+APP180ttmol?与H202损伤组比较,P&0.O13讨论APAP像许多镇痛药一样属于酚类,具有天然的抗氧化作用.APAP的抗氧化作用已得到较多的体外实验证实q.本实验研究APAP对H0引起的心肌细胞损伤是否有保护作用并探讨其机制.近年来活性氧自由基对心脏的损伤作用已经引起人们足够的重视.研究表明,在多种病理过程中,氧自由基及由它引起的脂质过氧化发挥极其重要的作用,如心肌缺血再灌注时会造成抗氧化保护机制的改变,同时产生大量的自由基,活性氧自由基对心脏的损伤作用已引起人们的广泛重视,近期研究认为自由基导致的细胞凋亡是心肌受损的主要途径【910.氧自由

15、基直接参与心肌细胞凋亡也已得到证实【l】引.研究发现,高浓度的氧自由基对细胞的作用是导致坏死,低浓度的氧自由基会导致细胞凋亡.H0是ROS的一种,可以在细胞外诱导细胞凋亡,UV,离子射线作用细胞后,细胞内也可产生HO,它作为信使参与细胞内氧化还原途径,也可致细胞凋亡MJ.细胞凋亡是指在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,通过启动内部机制,主要是内源性DNA内切酶的激活,自己结束其生命的过程.在整个过程中涉及到一系列特殊基因的表达,随之细胞发生特征性的形态学和生化变化.Caspsse一3含有227个氨基酸残基,其编码分子量为32kD,是,细胞凋亡过程中重要的终末剪切酶,通常以无活性的酶原形式

16、存在,凋亡信号使其转变成有活性的酶,在凋亡中所起的作用不可替代.作为凋亡终末剪切酶,Caspsse一3的激活是细胞凋亡最具有特征性的分子标志.本研究通过对培养心肌细胞的培养液中LDH活性,细胞内MDA含量及SOD活性的测定,表明20/xmol?L,60/xmol?L和180/xmol?L的APAP对H0引起的心肌细胞氧化损伤表现出保护作用,并随浓度增加作用增强.通过对Caspase一3活性的检测,表明APAP在该浓度范围内对H0引起的培养心肌细胞凋亡有保护作用,并随浓度增加作用增强.总之,本实验结果表明APAP能减轻H0对心肌细胞的损伤作用,抑制H0引起的培养心肌细胞凋亡.其对培养心肌细胞H0

17、损伤的保护作用可能是通过其本身的抗氧化作用来实现的,但其确切机制仍有待于进一步的实验研究.参考文献:1MerrillG,McConnellP,VandykeK,eta1.Coronaryandmyo-cardialeffectsofacetaminophon:protectionduringiechemiareperfusionJ.AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2001,280（6）:H2631一H2638.2MerrillGF,GoldbergE.AntioxidantpropertiesofacetaminophenandcardioprotecfionJ.Basi

18、cResCardiol,2001,96（5）:423430.3MerrillGF.Acetaminophenandlowflowmyocardialischemia:efficacyandantioxidantmechanismsJ.AmJPhysiolHeartCitePhysiol,2002,282（4）:H1341一H1349.4GolfettiR,VanDykeK,RorkT,eta1.AcetaminopheninthepostisehemiareperfusedmyocardiumJ.ExpBiolMed朋叭m67卯对乙酰氨基酚对心肌细胞HO损伤的保护作用209（上接第203页）产

19、生保护作用的机制可能与抑制氧自由基的堆积,细胞内钙超载,细胞凋亡等有关.氧自由基堆积所引发的脂质过氧化反应参与了再灌注损伤.本研究中测定的SOD活性可反映机体清除氧自由基的能力,MDA含量则反映机体的脂质过氧化程度.本实验结果显示IPO使.肾组织SOD活性升高,MDA含量降低,提高了机体的抗氧化能力,减轻了脂质过氧化程度.IPO在某种意义上相当于有控制的缓慢间歇性复氧,可以减少突然复氧时氧自由基的爆发性产生,并刺激细胞内抗氧化酶和自由基清除剂的释放而发挥其保护作用.在缺血再灌注过程中,细胞凋亡是早期细胞死亡的主要原因之一.本研究结果中IPO组肾小管上皮细胞凋亡率明显下降,提示IPO可通过抑制肾

20、细胞凋亡减轻.肾IRI.其抗凋亡机制,一方面可能通过增强SOD活性,清除氧自由基和减轻脂质过氧化反应抑制细胞凋亡;另一方面可能与增加Bcl一2蛋白的表达有关.综上所述,IPO可通过增强.肾组织抗氧化能力,减少氧自由基的大量堆积,降低细胞凋亡而减轻.肾脏IRI;而且IPO是在移植术完成后,全面恢复灌流前实施,时间从容,方法简便,无疑具有一定的临床应用价值.1ZhaoZQ,Corverajs.HalkosME,eta1.Inhibilionofmyocar-dialinjurybyischemicpostconditioningduringreperfusion:cornparisionwithi

21、schemicpreconditioningJ.AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2003,285（2）:H579一H588.2ObalD,DettwilerS,FavocciaC,eta1.Effectofseyouranepreconditiononischchemia/reperfusioninjuryintheratkidneyinvivoJ.EurJAnaesthesiol,2006,23:3193263ToosyN,McmorrisEL,GracePA.MathieRT.Ischaemicpre?conditioningprotectstheratkidneyf

22、romreperfusioninjuryJ.BrJUrolInt,1999,84:489494.4ParkKM,KimjI,AhnY,eta1.TestosteroneisresponsibleforenhancedsusceptibilityofmalestoischemicrenalinjuryJ.JBiolChem,2004,279:5228252292.5SunHY,WangNP,KerendiF,eta1.HypoxicpostconditioningreducescardiomyocytelossbyinhibitingROSgenerationandintracellularCa2ovedoadJ.AmJPhysiolHeartCircPhysiOl,2005.288:H1900一H19.6ZhangH,TianJM,WangXH.StudyonapoptosisanditscontrolgeneofmouseliveincoldperfusionandpreservationJ.ChinJExpSurgSeptember,2002,19（5）:421422.收稿日期:20080326