宠物食物中黄曲霉毒素B1的测定Word格式.docx

1、再吸取25mL此稀释液于 50mL容量瓶中，加硫酸（0.5+1000）稀释至刻度，相当于0.0001mol/L溶液。用1cm石英杯，在最大吸收峰的波长（接近350nm处） 用硫酸（0.5+1000）作空白，测得以上三种不同浓度的摩尔溶液的吸光度，并按式（1）计算出以上三种浓度的摩尔消光系数的平均值。式中：E1重铬酸钾溶液的摩尔消光系数； A测得重铬酸钾溶液的吸光度； c重铬酸钾溶液的摩尔浓度。再以此平均值与重铬酸钾的摩尔消光系数值3160比较，即求出利用仪器的校正因素。f利用仪器的校正因素； E测得的重铬酸钾摩尔消光系数平均值。假设f大于0.95或小于1.05，那么利用仪器的校正因素可略而不计

2、。3.14.2黄曲霉毒素B1标准溶液的制备：准确称取11.2mg黄曲霉毒素B1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光，置于4冰箱保留。该标准溶液约为10g/mL。用紫外分光光度计测此标准溶液的最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值。3.14.2.1计算X1黄曲霉毒素B1标准溶液的浓度，g/mL； A测得的吸光度值； f利用仪器的校正因素； M黄曲霉毒素B1的分子量312； E2黄曲霉毒素B1在苯-乙腈混合液中的摩尔消光系数，19800。依照计算，用苯-乙腈混合液调到标准溶液浓度恰为10.0g/mL，并用分光光度计查对其浓度。3.14.3纯度的测定：取5l 10 g/mL黄曲霉

3、毒素B1标准溶液，滴加于涂层厚度0.25mm的硅胶G薄层板上，用甲醇-三氯甲烷（4+96）与丙酮-三氯甲烷（8+92）展开剂展开，在紫外光灯下观看荧光的产生，必需符合以下条件：3.14.3.1在展开后，只有单一的荧光点，无其他杂质荧光点。3.14.3.2原点上没有任何残留的荧光物质。3.15黄曲霉毒素B1标准利用液：准确吸取1mL标准溶液（10g/mL）于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于1.0g黄曲霉毒素B1。吸取1.0mL此稀释液，置于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度，此溶液每毫升相当于0.2再吸取黄曲霉毒素B1标准溶液（0.2g/mL）1.0mL

4、置于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0.043.16次氯酸钠溶液（消毒用）：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均匀。另将80g工业用碳酸钠（Na2CO310H2O） 溶于500mL温水中，再将两液混合、搅拌，澄清后过滤。此滤液含次氯酸浓度约为25g/L。假设用漂粉精制备，那么碳酸钠的量能够加倍。所得溶液的浓度约为50g/L。污染的玻璃仪器用10g/L次氯酸钠溶液浸泡半天或用50g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后，即可达到去毒成效。4仪器4.1小型粉碎机。4.2样筛。4.3电动振荡器。4.4全玻璃浓缩器。4.5玻璃板：5cm20cm。4.6薄层板涂布器。4.7展开槽

5、：内长25cm、宽6cm、高4cm。4.8紫外光灯：100125W，带有波长365nm滤光片。4.9微量注射器或血色素吸管。5分析步骤5.1取样样品中污染黄曲霉毒素高的霉粒一粒能够左右测定结果，而且有毒霉粒的比例小，同时散布不均匀。为幸免取样带来的误差，必需大量取样，并将该大量样品粉碎，混合均匀，才有可能取得确能代表一批样品的相对靠得住的结果，因此采样必需注意以下几点。5.1.1依照规定采取有代表性样品。5.1.2对局部发霉变质的样品查验时，应单独取样。5.1.3每份分析测定用的样品应从大样经粗碎与持续多次用四分法缩减至0.51kg，然后全数粉碎。粮食样品全数通过20目筛，混匀。花生样品全数通

6、过10目筛，混匀。或将好、坏别离测定，再计算其含量。花生油和花生酱等样品不需制备，但取样时应搅拌均匀。必要时，每批样品可采取3份大样作样品制备及分析测定用，以观看所采样品是不是具有必然的代表性。5.2提取5.2.1玉米、大米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等。5.2.1.1甲法：称取20.00g粉碎过筛样品（面粉、花生酱不需粉碎），置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL 甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。振荡30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待基层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。取20.00mL甲醇水溶

7、液（相当于4g样品）置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层，如显现乳化现象可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风柜，于65水浴上通风挥干，然后放在冰盒上冷却23min后，准确加入1mL苯-乙腈混合液（或将三氯甲烷用浓缩蒸馏器减压吹气蒸干后，准确加入1mL苯-乙腈混合液）。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，假设有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上掏出

8、，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移于2mL具塞试管中。5.2.1.2乙法（限于玉米、大米、小麦及其制品）：称取20.00g粉碎过筛样品于250mL具塞锥形瓶中，用滴管滴加约6mL水，使样品湿润，准确加入60mL三氯甲烷，振荡30min，加12g无水硫酸钠，振摇后，静置30min，用叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于100mL具塞锥形瓶中。取12mL滤液（相当4g样品）于蒸发皿中，在65水浴上通风挥干，准确加入1mL苯-乙腈混合液，以下按5.2.1.1自“用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合”起，依法操作。5.2.2花生油、香油、菜油等：称取4.00g样品置于小烧杯中，用20mL

9、正己烷或石油醚将样品移于125mL分液漏斗中。用20mL甲醇水溶液分次洗烧杯，洗液一并移入分液漏斗中，振摇2min，静置分层后，将基层甲醇水溶液移入第二个分液漏斗中，再用5mL甲醇水溶液重复振摇提取一次，提取液一并移入第二个分液漏斗中，在第二个分液漏斗中加入20mL三氯甲烷，以下按5.2.1.1自“振摇2min，静置分层”起，依法操作。5.2.3酱油、醋：称取10.00g样品于小烧杯中，为避免提取时乳化，加0.4g氯化钠，移入分液漏斗中，用15mL三氯甲烷分次洗涤烧杯，洗液并入分液漏斗中。以下按5.2.1.1自“振摇2min，静置分层”起，依法操作，最后加入2.5mL苯-乙腈混合液，此溶液每毫

10、升相当于4g样品。或称取10.00g样品，置于分液漏斗中，再加12mL甲醇（以酱油体积代替水，故甲醇与水的体积比仍约为55+45），用20mL三氯甲烷提取，以下按5.2.1.1自“振摇2min，静置分层”起，依法操作。最后加入2.5mL苯-乙腈混合液。此溶液每毫升相当于4g样品。5.2.4干酱类（包括豆鼓、腐乳制品）：称取20.00g研磨均匀的样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加入20mL正己烷或石油醚与50mL甲醇水溶液。振荡30min，静置片刻，以叠成折叠式快速定性滤纸过滤，滤液静置分层后，取24mL甲醇水层（相当8g样品，其中包括8g干酱类本身约含有 4mL水的体积在内）置于分液漏斗中，

11、加入20mL三氯甲烷，以下按5.2.1.1自“振摇2min，静置分层”起，依法操作。最后加入2mL苯-乙腈混合液。5.2.5发酵酒类：同5.2.3处置方式，但不加氯化钠。5.3测定5.3.1单向展开法5.3.1.1薄层板的制备：称取约3g硅胶G，加相当于硅胶量23倍左右的水，使劲研磨12min至成糊状后当即倒于涂布器内，推成 5cm20cm，厚度约0.25mm的薄层板三块。在空气中干燥约15min后，在100活化2h，掏出，放干燥器中保留。一样可保留23d，假设放置时刻较长，可再活化后利用。5.3.1.2点样：将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血色素吸管滴

12、加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距约为1cm，点直径约3mm。在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。滴加样式如下：第一点：10L黄曲霉毒素B1标准利用液（0.04g/mL）。第二点：20L样液。第三点：L样液+10?L0.04g/mL黄曲霉毒素B1标准利用液。第四点：L0.25.3.1.3展开与观看：在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，掏出挥干。再于另一展开槽内加10mL丙酮-三氯甲烷（8+92），展开1012cm，掏出。在紫外光下观看结果，方式如下。5.3.1.3.1由于样液点上加滴黄曲霉毒素B1标准利用液，可使黄曲霉毒素B1标准点与样液中的黄曲霉毒

13、素B1荧光点重叠。如样液为阴性，薄层板上的第三点中黄曲霉毒素B1为0.0004g，可用作检查在样液内黄曲霉毒素B1最低检出量是不是正常显现；如为阳性，那么起定性作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B1为0.002g，要紧起定位作用。5.3.1.3.2假设第二点在与黄曲霉毒素B1标准点的相应位置上无蓝紫色荧光点，表示样品中黄曲霉毒素B1含量在5g/kg以下;如在相应位置上有蓝紫色荧光点，那么需进行确证实验。5.3.1.4确证实验：为了证明薄层板上样液荧光系由黄曲霉毒素B1产生的，加滴三氟乙酸，产生黄曲霉毒素B1的衍生物，展开后此衍生物的比移值约在0.1左右。于薄层板左侧依次滴加两个点。L 0.04

14、于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反映5min后，用吹风机吹热风2min后，使热风吹到薄层板上的温度不高于40。再于薄层板上滴加以下两个点。再展开（同5.3.1.3），在紫外光灯下观看样液是不是产生与黄曲霉毒素B1标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。5.3.1.5稀释定量：样液中的黄曲霉毒素B1荧光点的荧光强度如与黄曲霉毒素B1标准点的最低检出量（0.0004g）的荧光强度一致，那么样品中黄曲霉毒素B1含量即为5如样液中荧光强度比最低检出量强，那么依照其强度估量减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧

15、光强度一致为止。滴加式样如下：依照情形滴加10依照情形滴加15依照情形滴加205.3.1.6计算X2样品中黄曲霉毒素B1的含量，g/kg； V1加入苯-乙腈混合液的体积，mL； V2显现最低荧光时滴加样液的体积，mL； D样液的总稀释倍数； m1加入苯-乙腈混合液溶解时相当样品的质量，g； 0.0004黄曲霉毒素B1的最低检出量，g。结果的表述：报告测定值的整数位。5.3.2双向展开法如用单向展开法展开后，薄层色谱由于杂质干扰掩盖了黄曲霉毒素B1的荧光强度，需采纳双向展开法。薄层板先用无水乙醚作横向展开，将干扰的杂质展至样液点的一边而黄曲霉毒素B1不动，然后再用丙酮-三氯甲烷（8+92）作纵向

16、展开，样品在黄曲霉毒素B1相应处的杂质底色大量减少，因此提高了方式灵敏度。如用双向展开中滴加两点法展开仍有杂质干扰时，那么可改用滴加一点法。5.3.2.1滴加两点法5.3.2.1.1点样：取薄层板三块，在距下端3cm基线上滴加黄曲霉毒素B1标准利用液与样液。即在三块板的距左侧缘0.81cm处各滴加10g/mL），在距左侧缘2.83cm处各滴加20L样液，然后在第二块板的样液点上加滴10g/mL），在第三块板的样液点上加滴10L 0.25.3.2.1.2展开5.3.2.1.2.1横向展开：在展开槽内的长边置一玻璃支架，加10mL无水乙醇，将上述点好的薄层板靠标准点的长边置于展开槽内展开，展至板端

17、后，掏出挥干，或依照情形需要时可再重复展开12次。5.3.2.1.2.2纵向展开：挥干的薄层板以丙酮-三氯甲烷（8+92）展开至1012cm为止。丙酮与三氯甲烷的比例依照不同条件自行调剂。5.3.2.1.3观看及评定结果：5.3.2.1.3.1在紫外光灯下观看第一、二板，假设第二板的第二点在黄曲霉毒素B1标准点的相应处显现最低检出量，而第一板在与第二板的相同位置上未显现荧光点，那么样品中黄曲霉毒素B1含量在5g/kg以下。5.3.2.1.3.2假设第一板在与第二板的相同位置上显现荧光点，那么将第一板与第三板比较，看第三板上第二点与第一板上第二点的相同位置上的荧光点是不是与黄曲霉毒素B1标准点重

18、叠，若是重叠，再进行确证实验。在具体测定中，第一、二、三板能够同时做，也可依照顺序做。如按顺序做，当在第一板显现阴性时，第三板能够省略，如第一板为阳性，那么第二板能够省略，直接作第三板。5.3.2.1.4确证实验：另取薄层板两块，于第四、第五两板距左侧缘0.81cm处各滴加10g/mL）及1小滴三氟乙酸；在距左侧缘2.83cm处，于第四板滴加20L样液及1小滴三氟乙酸;于第五板滴加20L样液、10g/mL）及1小滴三氟乙酸，反映5min后，用吹风机吹热风2min，使热风吹到薄层板上的温度不高于40。再用双向展开法展开后，观看样液是不是产生与黄曲霉毒素B1标准点重叠的衍生物。观看时，可将第一板作

19、为样液的衍生物空白板。如样液黄曲霉毒素B1含量高时，那么将样液稀释后，按5.3.1.4做确证实验。5.3.2.1.5稀释定量：如样液黄曲霉毒素B1含量高时，按5.3.1.5稀释定量操作。如黄曲霉毒素B1含量低，稀释倍数小，在定量的纵向展开板上仍有杂质干扰，阻碍结果的判定，可将样液再做双向展开法测定，以确信含量。5.3.2.1.6计算：同5.3.1.6。5.3.2.2滴加一点法5.3.2.2.1点样：即在三块板距左侧缘0.81cm处各滴加20?L样液，在第二板的点上加滴10g/mL），在第三板的点上加滴10L黄曲霉毒素B1标准溶液（0.25.3.2.2.2展开：同5.3.2.1.2的横向展开与纵

20、向展开。5.3.2.2.3观看及评定结果：在紫外光灯下观看第一、二板，如第二板显现最低检出量的黄曲霉毒素B1标准点，而第一板与其相同位置上未显现荧光点，样品中黄曲霉毒素B1含量在5如第一板在与第二板黄曲霉毒素B1相同位置上显现荧光点，那么将第一板与第三板比较，看第三板上与第一板相同位置的荧光点是不是与黄曲霉毒素B1标准点重叠，若是重叠再进行以下确证实验。5.3.2.2.4确证实验：另取两板，于距左侧缘0.81cm处，第四板滴加20L样液、1滴三氟乙酸;第五板滴加20g/mL黄曲霉毒素B1标准利用液及1滴三氟乙酸。产生衍生物及展开方式同5.3.2.1.4。再将以上二板在紫外光灯下观看，以确信样液

21、点是不是产生与黄曲霉毒素B1标准点重叠的衍生物，观看时可将第一板作为样液的衍生物空白板。通过以上确证实验定为阳性后，再进行稀释定量，如含黄曲霉毒素B1低，不需稀释或稀释倍数小，杂质荧光仍有严峻干扰，可依照样液中黄曲霉毒素B1荧光的强弱，直接用双向展开法定量。5.3.2.2.5计算：第二篇第二法6原理样品中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反映，多余的游离抗体那么与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准比较来测定含量。7试剂7.1抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，由卫生部食物卫生监督查验所进行质量操纵。7.2人工抗原：AFB1-牛血清白蛋白结合物。7.3黄曲霉毒素B

22、1标准溶液。7.3.1黄曲霉毒素B1标准溶液的制备：用甲醇将黄曲霉毒素B1配制成1mg/mL溶液，再用甲醇-PBS溶液（20+80）稀释至约10g/mL，紫外分光光度计测此溶液最大吸收峰的光密度值，代入式（5）计算：式中：X该溶液中黄曲霉毒素B1的浓度，g/mL;A测得的光密度值;M黄曲霉毒素B1的分子量312;E摩尔消光系数，21800;f利用仪器的校正因素。依照计算将该溶液配制成10g/mL标准溶液，检测时，用甲醇-BS溶液将该标准溶液稀释至所需浓度。7.4三氯甲烷。7.5甲醇。7.6石油醚。7.7牛血清白蛋白（BSA）。7.8邻苯二胺（OPD）。7.9辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠I

23、gG。7.10碳酸钠。7.11碳酸氢钠。7.12磷酸二氢钾。7.13磷酸氢二钠。7.14氯化钠。7.15氯化钾。7.16过氧化氢（H2O2）。7.17硫酸。7.18ELISA缓冲液。7.18.1包被缓冲液（PH9.6碳酸盐缓冲液）的制备：Na2CO31.59gNaHCO32.93g加蒸馏水至1000mL。7.18.2磷酸盐缓冲液（PH7.4PBS）的制备：KH2PO40.2gNa2HPO412H2O2.9gNaCl8.0gKCl 0.2g7.18.3洗液（PBS-T）的制备：PBS加0.05%（V/V）吐温-20。7.18.4抗体稀释液的制备：BSA 1.0g加PBS-T至1000mL。7.1

24、8.5底物缓冲液的制备。7.18.5.1A液（0.1mol/L柠檬酸水溶液）：柠檬酸（C6H8O7H2O） 21.01g，加蒸馏水至1000mL。7.18.5.2B液（0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）：12H2O 71.6g，加蒸馏水至1000mL。7.18.5.3用前按A液+B液+蒸馏水为24.3+25.7+50的比例（体积比）配制。7.18.6封锁液的制备：同抗体稀释液。8仪器8.1小型粉碎机。8.2电动振荡器。8.3酶标仪，内置490nm滤光片。8.4恒温水浴锅。8.5恒温培育箱。8.6酶标微孔板。8.7微量加样器及配套吸头。9分析步骤9.1取样，同5.19.2提取9.2.1大米和小米

25、（脂肪含量小于3.0%）的提取（脂肪含量参照食物成份表，中国预防医学科学院营养与食物卫生监督查验所编著，1991年8月，第一版）样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中。准确加入60mL三氯甲烷，盖塞后滴水封严。150r/min振荡30min。静置后，用快速定性滤纸过滤于50mL烧杯中。当即取12mL滤液（相当4.0g样品）于75mL蒸发皿中，65水浴通风挥干。用2.0mL20%甲醇-PBS分三次（0.8mL、0.7mL、0.5mL）溶解并完全冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管，加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当于2.0g样品。9.2.2玉米的提取（脂肪含量3.0%5.0%

26、）样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中，准确加入50.0mL甲醇-水（80+20）溶液和15.0mL石油醚，盖塞后滴水封严。用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中。待分层后，放出基层甲醇-水溶液于50mL烧杯中，从中取 10.0mL（相当于4.0g样品）于75mL蒸发皿中。以下按9.2.1自“65水浴通风挥干”起，依法操作。9.2.3花生的提取（脂肪含量15.0%45.0%）样品去壳去皮粉碎后称取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，准确加入100.0mL甲醇水（55+45）溶液和30mL石油醚。盖塞后滴水封严。静置15min后用快速定性滤纸过滤于125mL分液

27、漏斗中。待分层后，放出基层甲醇-水溶液于100mL烧杯中，从中取20.0mL（相当于4.0g样品）置于另一125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层（如有乳化现象可滴加甲醇促使分层）。放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中。再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷一并于蒸发皿中，以下按9.2.1自“65水浴通风挥干”起，依法操作。9.2.4植物油的提取用小烧杯称取4.0g样品，用20.0mL石油醚，将样品移于125mL分液漏斗中，用20.0mL甲醇-水（55+45）溶液分次洗烧杯，溶液一并移于分液漏斗中（精炼油4.0g样为4.525mL，直接用移液器加入分液漏斗，再加溶剂