细胞工程思考题答案 杨淑慎主编Word格式.docx

1、5、动物细胞培养常用的培养基组成成分有哪几类，在离体培养过程中有哪些作用？1）天然培养基 对促进细胞生长繁殖、粘附及中和物质的毒性有一定作用。2）合成培养基 血清的加入对培养非常有效，但对培养产物的分离纯化和检测会造成不便。3）无血清培养基 细胞外基质能帮助细胞附着和铁壁；低分子营养成分是细胞生长和代谢所需的；激素与生长因子促进细胞生长繁殖；酶的抑制剂，保护细胞不受培养基内残留酶的损伤。6、初代培养时，接种的一般程序是什么？1）在接种前打开超净工作台紫外灯照射2030min，关闭紫外灯后，打开超净工作台的风机10min以上，开始无菌操作。2）接种人员先洗净，在缓冲室内换好经过消毒的工作服，带上

2、口罩，并换上拖鞋等。3）上超净工作台后，用酒精棉球认真擦拭双手，特别是指甲处，然后擦拭工作台面及四周，装有培养基的培养器皿和盛外植体的烧杯也要用酒精擦拭消毒后，再放进工作台。4）先用酒精棉球擦拭接种工具，然后在酒精灯火焰上进行灼烧灭菌或放在接种器械灭菌器中灭菌，灭菌后放在器械架上使其自然冷却。5）把植物材料放在75%乙醇中浸泡约30s，再用0.1%的升汞中浸泡510min，浸泡时刻进行搅动，使植物材料与消毒剂有良好的接触，然后用无菌水冲洗35次。6）接种时培养瓶瓶口要在酒精灯火焰附近，并在接种前后灼烧瓶口。7）接种结束后，清理和关闭超净工作台。7、配制培养基时，加入一定量的植物生长调节物质，它

3、们在离体培养过程中有哪些作用？植物激素是植物细胞生长最适宜的调节物质，它能诱导细胞分裂、愈伤组织再分化以及胚状体发育。植物激素主要包括生长素类、细胞分裂素类和赤霉素类，有时也使用脱落酸、乙烯等物质。8、什么是生物安全实验室？目前，生物安全实验室的种类有哪些，各有什么特点？1）生物安全实验室是指对由动物、植物和微生物等生物体给人类健康和自然环境可能造成不安全的防范，主要是针对病原微生物或具有潜在危害的重组DNA等生物危险的方法而建起的安全实验室。2）BSL-1（P1） 对动、植物和环境危害较低、不会引发疾病BSL-2（P2） 对动、植物和环境有中等危害或具有潜在危害的致病因子BSL-3（P3）

4、可通过气溶胶使人传感上严重的甚至是致命的致病因子，对动、植物和环境有高度危害；通常有预防治疗措施。BSL-4（P4） 对动、植物和环境有高度危险性；通过气溶胶途径传播途径不明，没有预防措施第三章1.基本概念细胞的全能性：是指细胞具有发育成完整个体的遗传潜能。也可以指个体某个器官或组织已经分化的细胞在适宜的条件下再生成完整个体的遗传潜能。外植体：是指由活体植物体上提取下来的，接种在培养基上用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。愈伤组织：脱分化后的细胞经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团，称之愈伤组织（callus）极性：通常是指在器官、组织甚至细胞

5、中，在不同的轴向上存在某种形态结构和生理生化上的梯度差异。细胞分化：是指发育起始状态的合子沿个体发育方向不断分化出形态结构、生理功能不同的细胞、组织、器官而最终形成完整植株的过程。即由于细胞的分工而导致其结构和功能改变或发育方式改变的过程。在细胞水平上，细胞分化是指细胞在形态、结构和功能上发生改变的过程。去分化：已有特定结构和功能的植物组织，在一定的条件下，其细胞被诱导改变原有的发育途径，逐步失去原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚性细胞的过程叫脱分化或去分化（dedifferentiation）。再分化：脱分化细胞失去了分化的特征，但在特定条件下，可再次开始新的分化发育进程，最终形成各种组

6、织、器官或胚状体等，即再分化（rededifferentiation） 体细胞胚： （somatic embry）又称胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。人工种子：（artificial seeds）又称合成种子（synthetic seeds）或体细胞种子（somatic seeds）。就是将离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中形成的类似种子的颗粒。2.愈伤组织的形成大致可分为几个时期？各有何特点？答：可分为三个时期：（1）启动期 （诱导期）：主要是指细胞准备分裂的时期,需要采用合适的诱导剂,如NAA（萘乙酸）、IAA （吲哚乙酸

7、）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）等或细胞分裂素。 特征：距伤口较近的薄壁细胞略有增大，细胞质开始增多，相应的液泡缩小，核变大，呈球形，并由细胞边沿向中央移动；核仁明显变大，RNA含量增加，细胞恢复到具有分裂能力的状态，进入分裂的准备阶段，开始脱分化。（2）分裂期：进入分裂期就是脱分化的完成，同时也是再分化的开始。特征：被启动的细胞全面地进行活跃分裂。启动分裂的细胞体积变小，细胞内有旺盛的物质合成，并逐渐恢复到分生组织状态。如果此时经常更换培养液，愈伤组织就可以无限制地进行分裂而维持不分化状态。（3）分化期（形成期）：细胞内部开始发生一系列形态和生理的变化，分化出形态和功能不同的细胞。这一

8、时期与分裂期没有明显界限，一方面细胞不断分裂增殖，形成愈伤组织，另一方面细胞开始再分化。3.愈伤组织有何生长特征？（一）生长特性1、愈伤组织的类型根据组织学外观特征及其再生方式分为：胚性愈伤组织（EC）：质地较坚实，颜色有乳白或黄色，表面具有球形颗粒，生长缓慢。又可分为：致密型、易碎型。非胚性愈伤组织（NEC）：松疏易碎，颜色有黄色或褐色，表面粗糙，生长迅速。一般只有胚性愈伤组织有再生能力。某些植物的非胚性愈伤组织经适当继代培养可转变为胚性愈伤组织。4.外植体的发育程度对愈伤组织的诱导和继代有何影响？在胚性愈伤组织的诱导中，外植体的发育状态是一个十分重要的因素。外植体在发育过程中，存在一个很短

9、暂的时期，此期外植体内的某些细胞处于未分化或部分分化的状态，这些细胞具有形成胚性愈伤组织的能力，而处于这一发育时期之前或之后的外植体都只能形成非胚性愈伤组织。因此，选择适宜的取材时期可获得理想的培养结果。5、培养条件下的器官发生有哪些方式？影响其发生的因素有哪些？（1）有直接发生与间接发生两种途径。（2）影响其发生的因素有：1、外源激素的影响2、物理因素：光照、温度3、外植体的生理状态4、培养物的年龄6、生理学说、遗传学说和竞争学说各如何解释长期培养物形态发生潜力丧失的现象？1生理学说随着不断的培养继代的进行，培养组织或细胞中的内源激素平衡关系可能会发生改变，而导致不能形态发生。在这种情况下，

10、细胞虽然停止了器官和胚胎的分化，但并不一定就丧失了这种分化能力。因而，在这种情况下，如果改变外部培养条件，应该有可能使细胞的这种内在潜力得到恢复。2 遗传学说该假说认为，形态发生潜力的丧失是由于在培养细胞中的核的特性发生了改变，即细胞核内的遗传物质在培养继代过程中由于变异等原因而发生了改变或是突变。因此，可以推知，由这种原因所造成的形态发生潜力的丧失是不可逆的。 3竞争学说 首先，细胞对于生长素（2，4-D）抑制全能性表达的作用变得比较敏感； 其次，随着时间的推移，由于培养细胞在细胞学上的不稳定性，出现了缺乏胚性潜力的新的细胞系，这些细胞学上的变化不一定是染色体数目的变化，而可能只是遗传信息的

11、小的突变、丢失或易位， 按照这种假说，如果非胚性的细胞类型在所用的培养基中具有生长上的选择优势，在反复的继代培养中，非胚性细胞的群体将会逐步增加，而胚性成分则逐渐减少。到了一定时期之后，在培养物中已不再含有任何胚性细胞，这时若想再恢复它们的胚胎发生能力就不可能了。然而，如果在培养物中存在少量胚性细胞，只是由于处在支配地位的非胚性细胞的抑制作用，这些胚性细胞的全能性无法表达，在这种情况下，通过改变培养基成分，使之有选择地促进全能细胞的增殖，就应当有可能恢复该培养物的形态发生潜力。7、离体培养条件下，茎、芽和根的再生方式有几种？答:离体条件下植物细胞全能性实现的途径1、植物体细胞2、植物性细胞 可

12、诱导形成完整的植物体3、植物原生质体4、融合的原生质体可发育成杂种植物5、转基因的植物细胞可发育成具有新性状的植物体8、影响器官发生的主要因素有哪些？9、何谓胚状体？胚状体与合子胚有何异同？胚状体 离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，此现象无论在体细胞培养还是生殖细胞培养中均可以看到，因而统称为体细胞胚或胚状体。异同 细胞胚具有两极性，而器官发生是单极的。细胞胚维管组织分布是独立的Y 字形结构，形成的再生植株遗传性比器官发生的稳定。10、离体培养条件下，胚状体的产生有几种方式？直接从外植体上产生体细胞胚 由愈伤组织产生 悬浮培养中由胚性细胞复合体表面产生

13、 有悬浮培养中游离的单细胞产生 由单倍体细胞产生11、胚状体的发育大约要经过哪几个时期？一、诱导期 二、胚胎发育期12、影响胚状体发生的主要因素有哪些？因素：氮源 生长素 组织起源 13、如何区分离体培养条件下的不定芽与胚状体？体细胞经过了胚胎发育过程，具有胚根、胚芽和胚轴的完整结构，并与原外植体的微管组织无联系，是个相对独立的个体，区别于组织培养中以器官发生方式分化的不定芽和不定根。14、目前研制的人工种子结构是怎样的？人工种子由以下三部分组成：具有良好发育的体细胞胚，并能发育成正常完整植株：广义的体细胞胚由组织培养中获得的体细胞胚即胚状体、愈伤组织、原球茎、不定芽、顶芽、腋芽或小鳞茎等繁殖

14、体组成。人工胚乳，一般由含有供应胚状体养分的胶囊组成，养分包括矿质元素、维生素、碳源及激素等。胶囊之外的包膜称之为人工种皮，有防止机械损伤及水分干燥等保护作用。15、控制胚性细胞同步化的方法有哪些？抑制剂法促进细胞同步分裂；低温处理促进细胞同步分裂；渗透压控制同步化法；同步胚的分段收集筛选法；通气法。16、人工种子繁殖体如何处理？人工种子的制备要点有哪些？繁殖体的处理：体细胞胚形成后，需要在无激素培养基上经过一定阶段的后熟培养，然后进行脱水干燥，再将畸形胚选出后才能进行包埋。在脱水之前用ABA处理体细胞胚强迫其进入休眠，更有利于长期储存。微型变态器官繁殖体不能过度脱水，但亦需要适当干燥，除去表

15、面多余的水分，同时要进行表面消毒处理以防止包被后的感染。为了延长储存时间，需根据使用季节进行适当的休眠处理。以微芽为繁殖体时，不能进行脱水处理，但必需筛选生长健壮、组织充实的芽进行包埋。第十二章课后思考题（仅供参考）1.简述动物细胞培养的特点与营养需求针对动物细胞培养的各种方法，相应的培养特点：1、 转瓶（管）培养系统 （特点）优点：结构简单，投资少，技术熟练，重复性好，放大只需要简单地增加转瓶（管）数量。缺点：劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受限制。2、反应器贴壁培养 细胞贴附于固定的表面生长，不因为搅拌而跟随培养基一起流动。（

16、特点）优点：比较容易更换培养基，不需要特殊的分离和培养设备。扩大规模较难，不能直接监控细胞生长情况。3、 悬浮培养法，主要用于非贴壁依赖型细胞的培养。如杂交瘤细胞、淋巴细胞、和许多肿瘤细胞等。特点：用于实验室的普通悬浮反应器，是一种带有搅拌器的旋转瓶。4、固定化培养，固定化培养是将动物细胞与非水溶性载体结合起来，在生物反应器中进行大规模培养的方法。具有细胞生长密度高，抗剪应力和抗污染能力强，细胞易与产物分开，利于产物分离和纯化。针对与植物细胞培养的区别（即思考题7），动物细胞的培养有一下特点：a.培养基不同：植物细胞（固体培养基），动物细胞（液体培养基）b.培养基的成分不同：动物细胞培养必须利

17、用动物血清，植物组织培养则不需要。c.产物不同：植物组织培养最后一般得到新的植物个体，而动物细胞培养因为动物体细胞一般不能表达其全能性，因此得到的是同一种的细胞。d.原理不同：植物组织培养的原理为植物细胞的全能性，动物细胞培养的原理为细胞的增殖。营养需求：动物细胞培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。动物细胞培养成功的关键在于培养液中是否含有动物血清，因为由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，此外动物血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以促进细胞的发育。动物细胞培养液的特点：液体培养基、含动物血清。动物细胞培养的

18、条件：无菌、无毒的环境；营养物质（合成培养基）；温度和pH（36.50.5，7.27.4）；气体环境（氧气和二氧化碳）等。2.试述动物细胞培养在生物技术中的应用潜力a.生物制品的生产，（酶、生长因子、疫苗和单抗）b.转基因动物的培养 （转基因鱼、转基因小鼠）c.检测有毒物质 d.医学研究3、简述动物细胞工程技术应用的两面性。4、举例说明动物细胞培养的目的与用途。5、简述细胞冷冻的原理和方法。主要冻存方法：超低温保存。细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。快冻慢溶6、接触抑制与密度抑制有什么异同。接触抑制:细胞从接种到长满容器表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不

19、再增加接触抑制。密度抑制: 细胞接触汇合成片后，只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，但当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，发生密度抑制现象。8、试举一例说明细胞建系的全过程（列出主要方法、步骤及所需的仪器设备）。9、试述动物细胞生物反应器的发展趋势。第四章名词概念：微繁殖：是指在离体培养条件下，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行无菌培养，经过不断地切割和重复培养，使其增殖并再生形成完整植株，在短期内获得大量遗传性均一的个体的方法。繁殖系数：经一次增值培养或在一定时间段内由一个繁殖体所增殖获得的总繁殖体数或苗数。玻璃化：也称超水化作用，是离体培养过程中

20、试管苗发生形态、生理和代谢异常的现象。褐变：是指组织培养中，由于材料被切割而使多酚氧化酶活化将组织中的酚类物质氧化形成棕褐色的醌类物质，并向培养基中扩散，抑制培养物生长甚至导致其死亡的现象。原球茎：兰科植物的种子在萌发初期并不出现胚根，只是胚逐渐膨大，以后种皮的一端破裂，膨大的胚呈小圆锥状，称作原球茎。茎尖分生组织：指茎尖最幼龄叶原基上方的由2或3层分生细胞组成的很小区域，一般最大直径不超过0.1mm,长度0.25mm，最小的茎尖长度仅有几十微米，有时也称顶端分生组织。不定芽：相对于顶芽和腋芽，由植物的其他部位或器官、组织上通过器官发生重新形成的、无固定着生位置的芽统称为不定芽。2、植物离体无

21、性繁殖主要适用于哪些植物？与常规无性繁殖相比有什么优势？植物离体无性繁殖主要适用于园艺观赏植物、农作物、药用植物及经济林木的种苗生产。1周期短，便于控制培养条件。繁殖速度快，经济效益高。（2）占用空间小，不受地区、季节限制。（3）繁殖珍稀、濒临苗木和突变体，是优良品种培养的有效途径。（4）利物保持原来品种的特性。3、离体无性繁殖中,培养物的增殖方式有哪几种？离体无性繁殖中,培养物的增殖方式有 4种。1腋生枝型 特点（1）繁殖率高（2）能保持植物遗传稳定性（3）可缩短林木繁殖周期。2不定芽型（1）繁殖率非常高，但繁殖速度较慢； （2）遗传性稳定。3胚状体发生型（1）胚状体发生数量多，速度快，结构

22、完整，繁殖系数高；（2）遗传性稳定。4原球茎型是兰花种子萌发时产生的呈珠 粒状、缩短的、类似嫩茎的器官，可萌发成苗4、离体无性繁殖一般可分为哪几个阶段？简述其操作的一般程序。离体无性繁殖一般可分为5个阶段。1、植株的准备：供体植株应生长旺盛、健壮、不病虫害，并尽可能生长在干净的环境中。2、无菌培养物的建立：获得无菌材料并诱导外植体生长和发育。包括从供体植株上采取外植体进行消毒、接种及启动外植体生长等程序。3、培养物的增殖：通过反复培养使第一阶段获得的数量有限的嫩枝、芽苗、胚状体或原球茎等培养物的总量增加。4、生根培养：将增殖阶段形成的无根芽苗转移到生根培养基上诱导产生不定根，获得健壮的具有根、

23、芽、茎的完整小植株。5、试管苗的移栽及鉴定：移栽是将具根试管苗转移到土壤中的过程，是试管苗从离体培养逐步适应温室或田间生长环境的过程5 离体繁殖时外植体选择应注意哪些方面？生理状态和基因型 其中生理状态包括年龄、取材、季节、生长、环境部位6 离体繁殖中常见得技术问题有哪些? 如何克服或防止其发生？污染问题和褐变、玻璃化 污染问题预防措施）通风 ）去湿）光照）防霉5）改进外植体消毒方法或使用抗生素褐变防治措施1）选择合适的外植体：一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体。2）合适的培养条件：无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度和光照、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。3）使用抗氧化剂：在培养

24、基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。（4）使用吸附剂：使用聚乙烯基吡咯烷酮 、0.1%-0.5的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果玻璃化防治措施1）降低细胞分裂素的浓度，调节激素配合2）增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的渗透势3）降低氨态氮，提高硝态氮的含量；4）增加容器的气体交换，降低容器内相对湿度5）降低培养温度，增加自然光照。6）在培养基中添加间苯三酚、根皮苷或生长抑制剂等物质。7 要提高某种植物离体快繁的效率，可以采取哪些措施？8 试管苗与一般的种子苗相比有什么特点？试管苗的特点试管苗生长细弱，茎、叶表面角质层不发达。试管苗茎、叶虽呈

25、绿色，但叶绿体的光合作用较差。试管苗的叶片气孔数目少，活性差。试管苗根的吸收功能弱。9、脱除植物病毒病有哪些方法？其原理是什么？物理方法（1）、高温处理又称热疗法原理:一些病毒对热不稳定,在高于常温的温度下（35-40 ）即 钝化失活,繁殖力下降,失去侵染能力,而植物基本不受伤害.（2）、低温处理又称冷冻疗法原理：降低温度能使病毒活力下降。化学处理（1）.病毒抗血清预处理 ： 用齿舌兰环斑病毒（ORV）的血清处理兰属离体分生组织，提高了再生株中无ORV的植株频率。（2）.RNA抑制剂处理： 烟草愈伤组织培养基中加入2-硫脲嘧啶，可除去组织中马铃薯Y病毒（PVY）。放线菌D和放线菌酮能抑制原生质

26、体中病毒的复制。（3）.三氯唑核苷：病毒唑，化学名称1,2,4-3唑-3-酰胺-1-D-呋喃核苷，防治动物RNA病毒和DNA病毒病的广谱性抗病毒制剂。生物脱毒方法（原理：培养材料中通常不含病毒，可通过植物组织培养就行脱毒）（1）、茎尖分生组织培养（2）、微体嫁接脱毒（3）、愈伤组织培养脱毒（4）、珠心胚培养脱毒（5）、花药培养脱毒10、简述通过茎尖分生组织培养脱除植物病毒的一般程序选取感病程度轻的植株分离大小合适的茎尖分生组织茎尖分生组织培养病毒检验11、影响茎尖分生组织培养去除病毒的因素都有哪些？（1）、供体的生理状态和部位（2）、适当大小的茎尖分生组织的分离（3）、茎尖分生组织培养基的类型

27、和培养条件12、无病毒植物的检测方法有哪些？（1）、直接检测法:直接观察（2）、电镜检测法（3 ）、指示植物法（4）、血清学检测法（5）、分子检测技术：PCR技术、探针杂交技术13. 结合本章及前面所学的知识，你认为试管苗商业性生产中需要注意什么问题？进行试管苗商业性生产的企业在具备试管苗快繁生产技术、人员及相应的生产场地和设施等基本条件下，还应注意以下几点：（一）建立一套科学的试管苗生产管理体系（二）试管苗生产要以市场为导向（三）注重新产品、新技术的研发和创新、做好技术储备14. 利用假期，实际了解当地植物快繁企业的生茶经营情况。此题不考。第五章1. 分离植物单细胞的方法有哪些？有以下三种：（一）机械法:主要通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单细胞。（二）酶解法：主要是根据植物细胞壁的组成特点选用某一专一性水解酶，在温和条件下将壁物质分解掉，从而释放出细胞。（三）愈伤组织诱导法。2. 植物单细胞培养的方法有哪些？1、平板培养法单细胞在培养基中分布均匀，便于定点观察，易筛选；通气差，排泄物易积累造成细胞毒害2、看护培养简便、成功率高；不能在显微镜下直接观察.3、饲养层培养