植物组织培养实验报告Word格式文档下载.docx

1、5.培养基 植物组织培养常用的培养基为 MS 培养基。常用的凝固剂是琼脂,它的主要作用是使液体培养基凝固，琼脂本身并不提供任何营养，它只是一种高分予的碳水物从海藻中提取出来，仅溶解于热水，成为溶胶，冷却后（40以下）即凝固为固体状凝胶。琼脂的用量一般在 410克升之间。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解而丧失凝固能力，存放时间过久，琼脂变褐，也会逐失去凝固能力。MS 培养基属于富盐平衡培养基，特点是：无机盐浓度较高，元素间的比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，因而在培

2、养的过程中可维持较好的稳定性；营养丰富，在一般培养中无须额外加入复杂的有机成分；微量元素种类全，浓度高。这类培养基是目前使用最广泛的培养基。6.生长调节物质 包括天然植物激素额人工激素类似物。植物激素是一类植物自身合成、同时对其生长发育具有重要调节作用的有机化合物。生长调节物质对于离题培养中的细胞分裂分化、器官形成和个体再生等均起着重要而明显的调节作用。一般来说，基本培养基只能保证培养物的生存，维持其最低的生理活动，而只有植物激素的配合使用，才能完成离体培养物中按照需要设计的各个调节环节。常用的植物组培激素种类主要有生长素类、细胞分裂素类、赤霉素。1）生长素的生理作用主要是促进细胞分裂和生长，

3、有利于外植体脱分化并启动细胞分裂，有利于形成愈伤组织。同时生长素和细胞分裂素的协调作用，对于培养物的形态建立十分必要。在离体培养的分化调节中，生长素促进不定根的形成而抑制不定芽的发生。在液体培养中，生长素还有利于体细胞胚胎发生。常用的生长素有吲哚乙酸（IAA）、奈乙酸（NAA）、二氯苯氧乙酸（2，4-D）和吲哚丁酸（IBA）等。在使用 2，4-D时，必须严格控制使用浓度和培养时期，因为高浓度的 2，4-D常常抑制器官的发生，在分化培养时不能使用 2，4-D代替其他生长素。2）细胞分裂素的主要作用是促进细胞的分裂，调节器官分化，延迟组织衰老，增强蛋白质合成等。此外，它还能显着改善其他激素。离体培

4、养中，细胞分裂素能够促进不定芽的发生，与生长素协调使用能有效调控培养物的生长与分化。常用的细胞分裂素包括 6-卞基嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、异戊烯氨基嘌呤（2ip）、玉米素（ZT）等。3）赤霉素（GA）是一类广泛存在于植物体内的激素，目前已发现的天然赤霉素有20 多种。自然界植物体内的赤霉素具有促进细胞伸长生长、诱导花芽形成、打破种子休眠及诱导单性结实等生理功能。在离体培养条件下，赤霉素的主要作用时促进细胞伸长生长，与生长素协同作用对形成层的分化具有一定影响，同时还能刺激体细胞胚进一步发育成植株。三、实验材料、试剂和仪器设备 1.植物材料：马齿苋、番茄种子诱导的无菌苗、外植体（盘龙参、

5、波斯菊、金叶女贞、黄花苜蓿、菊花、香樟、杜鹃、月季）2.实验药品（试剂）：甲醛、MS 培养基母液（见表 1）、蔗糖、琼脂、1%升汞、酒精（75%和 90%）、NaOH、HCl、6-BA、NNA、无菌水；3.仪器设备和实验用具：高压灭菌锅、天平、pH计、超净工作台、电炉、酒精灯、镊子、解剖刀、剪刀、烧杯、培养瓶、量筒、烧杯、玻璃棒、广口试剂瓶、牛皮纸、滤纸、培养皿、药勺、支架、打火机等。四、实验步骤（一）培养基母液的配制（2016/3/4）1.MS 培养基贮备液配制 贮备液 I（g）（20）贮备液 III（mg）（100）MgSO4 7H2O 500mL FeSO4 7H2O 278 100mL

6、 NH4NO3 Na2EDTA 2H2O 373 CaCl2 2H2O 生长调节剂 KNO3 6-BA 50mg 50mL KH2PO4 NAA 50mg 贮备液 II（mg）（100）贮备液 IV（mg）（100）KI 100mL 肌醇 1000 100mL H3BO3 62 烟酸 5 MnSO4 4H2O 223 盐酸硫胺素 1 ZnSO4 7H2O 86 盐酸吡哆醇 5 Na2MoO4 2H2O 甘氨酸 20 CuSO4 5H2O 0.25 称量 溶解 混合 定容 CoCl2 6H2O 0.25 表 1 1）每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，定

7、容。2）贮备液 III需加热溶解。混合后调至，定容，保存在棕色玻璃瓶内。3）6-BA：1 mg/mL（溶于少量 1N盐酸后以蒸馏水定容）。NAA：1 mg/mL（先用少量 95%乙醇溶解后以蒸馏水定容）。4）各种母液配制完成后，分别用玻璃瓶贮存，贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，放入冰箱冷藏室保存。一般无机物质的母液在冰箱中可保存半年以上，有机物质的母液保存时间在半年以内，但若发现有沉淀或霉变,应立即需重新配制。2.其他试剂的配置 1）1 mol/L 的 NaOH：1 瓶 2）1 mol/LHCL：1 瓶 3）%的升汞或 2%次氯酸钠：每个超净工作台一瓶（用时处理 5-30min）4）7

8、075%酒精：每个超净工作台一瓶 5）95%酒精：每个超净工作台一瓶 6）75%酒精棉球：每个超净工作台一瓶（二）培养基的配制与灭菌 1.培养基配制 1）配制培养液（MS 培养液）：按每次配制 500 mL培养基计，用量筒或者移液管从各种母液中分别取出贮备液 I 25 mL、贮备液 II、各 5 mL；2）溶化琼脂：用粗天平分别称取 5g琼脂、15g 蔗糖放入 500 mL搪瓷缸中，加入蒸馏水 400 mL，用用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至 500 mL，搅拌均匀。3）调 pH：用滴管吸取物质的量浓度为 1

9、mol/L的 NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的 pH试纸（）测培养基的 pH，一直到培养基的 pH为为止（培养基的 pH必须严格控制在）。4）培养基的分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入组培瓶（50 mL或 100 mL）中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。组培瓶中培养基的量约 50 mL。每 500 mL培养基，可分装 1015瓶。5）培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。最后在组培瓶外壁贴上标签。2.培养基灭菌（高压灭菌）1）放培养瓶。将装有培养基的培养瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。如果没有金属小

10、筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。2）放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶（以上物品都要用牛皮纸封口），用牛皮纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等。3）待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在 98 kPa、下，灭菌 20 min。灭菌后取出培养瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。最好放置 1 d 后再使用。3.其他灭菌 1）不耐热的物质将采用过滤灭菌 如赤霉素、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素等。过滤灭菌的原理：溶液通过滤膜后，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。2）玻璃器皿及耐热用具等可采

11、用干热灭菌 即利用烘箱加热到 160-180 的温度来杀灭微生物。3）用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌（三）接种室和超净工作台的灭菌处理 1.接种室熏蒸灭菌 长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：甲醛、高锰酸钾熏蒸。甲醛的用量通常按每立方米空间 2-6毫升计算，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后，把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内（最好在碗或杯下面铺一张报纸，以利清洗），然后将甲醛也倒入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体。甲醛熏蒸接种室应至少在使用前 24 小时进行，熏蒸后密闭保

12、持 4 小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前 2小时进行。对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸 2.准备组培室 将组培室打扫干净，调至适宜温度 3.超净工作台处理 1）材料准备 用 75%酒精擦拭，准备好超净工作台内物品，包括酒精棉球、75%和 90%酒精、废液缸、打火机、酒精灯、支架、镊子、解剖刀、解剖剪等 2）灭菌处理 实验开始前先用 75%酒精擦拭工作台面，然后开启紫外灯，紫外照射 20min-30

13、min。关闭紫外灯，开启风机 10min 后打开日光灯。用 7075的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。（四）无菌苗的培养（2016/3/11）1.培养基配制（方法同（二）培养基的配制与灭菌）种子的萌发采用 1/2MS培养基 1/2MS 培养基 贮备液 贮备液 贮备液 贮备液 蔗糖 琼脂 15g 5g 2.马齿苋（番茄）种子处理 1）洗去浮尘和上漂的种子，挑选饱满种子，置于培养瓶中流水冲洗 30

14、min 后倒掉水备用；2）将种子置于培养瓶中，用 75%酒精消毒灭菌 3060s，用无菌水冲洗干净；3）用 1%升汞处理 810min，然后用无菌水冲洗 34次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌接种器械进行分离接种。3.接种及培养 1）用酒精擦洗工作台和手，对接种器具进行灼烧灭菌；2）打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子（90%酒精浸泡并灼烧）将培养材料置于培养基上，灼烧瓶口，盖上瓶塞。3）培养瓶贴上标签，做好标记，然后放到光照培养箱中或培养室培养架上进行培养，条件为 2000-3000LX，261，培养一周。实验结果：所有马齿苋无菌苗均染菌（未拍照）实验分析：马齿苋种子消毒、

15、灭菌时间不足 接种室和培养实灭菌不彻底，环境较脏 实验操作不正确 超净工作台不干净（五）愈伤组织诱导（2016/3/25）1.培养基的配制（方法同（二）培养基的配制与灭菌）愈伤组织诱导培养基 组别 6-BA NNA 贮备液 贮备液 贮备液 贮备液 蔗糖 琼脂 一%25mL 5mL 5mL 5mL 15g 5g 二%1%三%四 1%1%2.无菌苗和外植体的处理 1）无菌苗处理 从培养瓶中取出无菌苗，用无菌水洗净培养基，切成大小，叶片较大的进行裁剪，置于无菌培养皿备用；2）外植体处理 a将野外植物洗干净尘土并用洗衣粉刷干净；b将洗净植物切去叶柄，将叶片从叶脉处剪开，再切成 34 mm2 的小块；嫩

16、茎需切取两个节之间的节间部分，长约 1 cm，流水冲洗 30min；c将外植体置于培养瓶中，用 75%酒精持续消毒灭菌 18s，然后用无菌水冲洗 d用 1%升汞处理 1215min，然后用无菌水冲洗 34次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌解剖刀切去两端后进行接种。3.接种及培养（同无菌苗的建立）4.剔除长菌严重的培养瓶，其余继续培养 5.观察实验现象 实验结果：组别 材料 染菌率 枯死率 存活率 二 马齿苋 100%（2）所有叶柄基部没有散开，一起消毒 75%酒精 15s 升汞：15min 盘龙参 根 0 0 100%（2）盘龙参-叶绿色 0 100%盘龙参-叶基部 0 50%（

17、1）50%（1）苜蓿（花+叶）0 花-0 叶-50%花：100%叶：50%波斯菊叶 0 0 100%第一周（2016/4/8）材料 马齿苋 盘龙参根 结果 材料 盘龙参叶 盘龙参叶基部 结果 材料 苜蓿花+叶 波斯菊叶 结果 第二周（2016/4/15）材料 苜蓿花+叶 波斯菊叶 结果 开始长愈伤组织 无变化 愈伤组织长势良好 实验分析：1、仅有无菌苗染菌：无菌苗本身染菌，但未被发现；实验培养基凝固不彻底，粘到瓶子壁上；培养基 pH未调好；操作时，动作不正确 无菌苗仅用无菌水洗涤，未用酒精和升汞 2、外植体有部分枯死：灭菌过度，时间过长 3、盘龙参组织无变化：可能由于培养基中植物激素不适宜，培

18、养室温度、光照等不恰当 4、波斯菊长愈伤组织明显，此培养基较适宜波斯菊 5、不同植物对植物激素的要求不同，所以在同一浓度下出现不同的结果（六）生根实验（类似扦插）（2016/4/15）1.生根培养基配制（方法同（二）培养基的配制与灭菌）生根培养基（1/2MS）组别 6-BA NNA 贮备液 贮备液 贮备液 贮备液 蔗糖 琼脂 二 0%15g 5g 三%四%2.无菌苗和外植体的处理 1）无菌苗处理 从培养瓶中取出无菌苗，用无菌水洗净培养基，保留部分幼嫩叶片，切成大小（材料尽量幼嫩），置于无菌培养皿备用；b将洗净植物切去老叶，保留顶端嫩叶、嫩茎，切成长约 2 cm 茎段，流水冲洗30min；c将外

19、植体置于培养瓶中，用 75%酒精持续消毒灭菌 18s，然后用无菌水冲洗 d用 1%升汞处理 13min，然后用无菌水冲洗 34次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌解剖刀切去两端后（约）进行接种。3.接种及培养（同无菌苗的建立）一瓶接种 23个茎段，直接插入培养基中，形态学上端朝上；4.剔除长菌严重的培养瓶，其余继续培养 5.观察实验现象 实验结果：组别 材料 染菌率 枯死率 存活率 二 菊花茎（1）0 100%0 75%酒精 15s 升汞：15min 月季茎（2）100%（2）月季花（2）第一周 50%（1）第二周 100%（2）女贞茎（4）0 100%（1 长愈伤组织、3无变化）

20、香樟（1）100%（有愈伤）杜鹃（1）100%波斯菊茎（1）100%（略长根，第二周长菌）第一周（206/4/29）材料 月季花 月季茎 结果 绽开，无根 花苞长真菌，无根 长真菌，无根 叶稍长，无根，未染菌 材料 菊花茎 香樟 结果 褐化，无根 无根 有白色菌点 or愈伤组织 材料 杜鹃 波斯菊茎 结果 无根，几乎无变化 长势旺盛，略微生根 材料 女贞茎 结果 无变化，无根 第二周（2016/5/6）其余材料均无明显变化 材料 月季花 波斯菊 结果 开始枯萎，无根 波斯菊开始长菌，黄色细菌，菌落光滑 稍长根，但不明显 综合对比 不同浓度 NAA对波斯菊生根的影响（2016/5/6）NAA浓度

21、 低 高 实验结果显示：较高浓度 NAA诱导长根效果更好。如图所示，随 NAA浓度的增加，波斯菊生根越多，长势越好（七）生芽实验（2016/5/6）1.生芽培养基配制（方法同（二）培养基的配制与灭菌）生芽培养基（MS）组别 6-BA NNA 贮备液 贮备液 贮备液 贮备液 蔗糖 琼脂 一 5%15g 5g 二 5%三 4%四 4%2.无菌苗和外植体的处理（同上）1）无菌苗处理 从培养瓶中取出无菌苗，用无菌水洗净培养基，切成大小，叶片较大的进行裁剪，置于无菌培养皿备用；b将洗净植物除叶留芽，切成长约 2 cm，流水冲洗 30min；组别 材料 染菌率 枯死率 存活率 长芽率 二 波斯菊 第三周有

22、染菌%100%75%酒精15s 升汞：15min 番茄 100%第一周（2016/5/20）材料 波斯菊 结果 有部分死亡，未死亡的均已生芽，长势好 该培养基适宜用于诱导波斯菊生芽 材料 番茄 结果 无生芽趋势，但是可能要长愈伤组织 该培养基浓度不适宜诱导番茄生芽 第二周（2016/5/27）材料 波斯菊 结果 茎段生芽长势良好，开始形成愈伤组织 材料 番茄 结果 番茄长势较波斯菊缓慢，第二周生芽（腋芽较多），也形成愈伤组织 第三周（2016/6/3）材料 波斯菊 结果 部分长势良好，愈伤组织和芽军生长旺盛；波斯菊部分死亡，部分开始长菌，多数为真菌：1、可能是植物本身含有的菌，培养一段时间后开

23、始生长；2、培养瓶盖子上部的通气孔有破损 3、培养室内不干净 材料 番茄 结果 番茄是无菌苗，未出现染菌情况。芽和其遇上组织的生长旺盛 五、注意事项 1.配制培养液时应注意：1）在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；2）用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗 2 次；3）量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取 1种，划掉 1种，以免出错。4）溶化琼脂需要注意的是，在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需

24、要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。2.外植体放入培养基时，注意方向。每瓶放置外植体的数量，应该根据培养瓶瓶的大小来确定，一般放置胡萝卜 4-6 块。注意外植体也不要放得太少，以充分利用培养基中的营养成分。3.接种用的酒精灯，火焰不要调得太高，接种时应靠近酒精灯火焰操作，接种的速度要快。4.接种时严防超净工作台内着火。5.无菌操作培养时：1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。2）不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。3）为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。4）工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。5）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。6）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。7）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。