高效液相色谱仪校验规程.docx

1、高效液相色谱仪校验规程标 准 文 件Standard document文件编号Document No.SOP-LOP-790-8/00高效液相色谱仪校验规程Calibration SOP for HPLC页 码Page1 / 9状 态Status正式Formal备 份 号Control No.起 草 人Written by起草日期Written date年 月 日颁发部门Issued department质量管理部Quality department审 核 人Reviewed by审核日期Reviewed date年 月 日批 准 人Approved by批准日期Approved date年

2、月 日生效日期Effective date年 月 日分发部门Distributed department：质量负责人 质量管理部 QA QC1、目的Objective：建立高效液相色谱仪部校验规程，确保校验工作规、顺利进行。2、围Scope ：本规程适用于本公司使用的高效液相色谱仪（紫外-可见光检测器/二极管阵列检测器）的校验。3、职责Responsibilities：3.1 培训职责：本文件起草人或审核人或批准人负责对质量管理部全体人员培训。3.2 QC：负责制定本规程，并对本规程的实施负责。3.3 QA：负责监督和检查本规程的实施。4、定义Definition：无。 5、程序Procedu

3、res：5.1 依据计量校验规程JJG 705-2002液相色谱仪，安捷伦液相说明书，岛津液相说明书。5.2 备件及材料5.2.1水：HPLC级水。5.2.2化学试剂：乙腈（HPLC）、丙酮（分析纯）。5.2.3咖啡因标准品。5.2.4咖啡因标样。0.005 mg/ml, 0. mg/ml, 0.025 mg/ml,0.050 mg/ml,0.125 mg/ml和0.250 mg/ml咖啡因水溶液。5.2.5色谱柱： 4.6mm250mm，C18，5m。5.2.6 容量瓶：10ml。5.2.7玻璃注射器。5.2.8 限流阻尼管。5.2.9 分析天平。5.2.10 秒表。5.2.11 热电偶5.

4、3 校验项目及技术指标5.3.1泵性能的测试表1校 验 项 目指 标流量设定值(ml/min)0.51.01.52.02.5流量设定值误差，|SS |5%2%2%2%2%流量稳定性误差，SR 3%2%2%2%2%5.3.2柱温箱温度稳定性测试*表2校 验 项 目指 标温度设定值 ()2025303540温度设定值误差|T|2控温稳定性误差TC 1备注：如药典专论规定的特定柱温，不在以上温度围之，则对分析该品种的仪器增加该温度点校验，校验项目和可接受指标相同。5.3.3 检测器性能测试表3 校 验 项 目指 标基线噪声：510-4AU基线漂移：510-3AU/h波长准确度：|2nm线性测试： 相

5、关系数R 响应因子f的RSD 0.9995.0%5.3.4进样器性能测试表4校 验 项 目指 标进样器精密度测试：定性重复性(Rt)RSD定性 1.0%定量重复性(峰面积) RSD定量 2.0%自动进样器线性测试*： 相关系数R响应因子f的RSD0.9995.0%5.3.5梯度组成的测试*表5校 验 项 目指 标梯度准确度|TSH-MSH|2%梯度准确度的精密度0.5%注：*表示该项目的部校验取决于仪器的配置，有该配置则为必检项目。5.4 校验法5.4.1校验通则5.4.1.1 HPLC的部校验由仪器所属部门经培训的使用者按本规程进行校验，其校验项目依仪器配置和使用围而定。5.4.1.2 政府

6、部门每一年对HPLC进行校验，每六个月部对HPLC进行一次校验；仪器配置的关键部件大修或更换后，可参考本规程对该部件相关的项目进行校验，以对仪器的性能进行确认。5.4.1.3 校验时，同时检查、确认仪器的安装，使用环境符合要求，仪器处于正常的状态下，并检查、确认仪器的接线牢固，接地良好。5.4.1.4 不同配置的仪器，须按照规定的校验项目及指标进行部校验，以保证该仪器的所有使用功能均进行了校验。5.4.2 泵性能的测试SS和SR的测定5.4.2.1 测试条件： 流动相：水；色谱柱：限流阻尼管。5.4.2.2 测试：分别设定流速为0.5ml/min， 1.0ml/min，1.5ml/min，2.

7、0ml/min，2.5ml/min等值进行校验，这些流速覆盖了实验室使用的流速围。待流速稳定后，在流动相流出口处用容量瓶准确地收集流动相10.0ml，同时用秒表计时，各测量3次，按公式(1)、(2)计算SS和SR，并以下表所列容记录测试数据和结果。表6 泵性能的测试 泵流量设定值： 流动相体积： 次数项目123收集时间t(秒)流量实测值Fm(ml/min)泵流量设定值误差SS泵流量稳定性误差SR5.4.3柱温箱温度稳定性测试T 和Tc的校验5.4.3.1测试将测温仪之热电偶固定在柱温箱中央，关好柱箱门。以限流阻尼管替代色谱柱，分别设定柱温箱温度为20，25，30，35，40等值进行校验，这些温

8、度覆盖了实验室使用的柱温围。待测温仪指示温度稳定后，记录温度显示值，每隔5分钟测一次，每个温控点测定1小时，求出平均值，并以下表所列容记录测试数据和结果。设定值与平均值之差为设定值误差T，13次测量值中最大值与最小值之差为控温稳定性误差Tc。表7 柱温箱温度稳定性测试温度设定值： 次数项目12345678910111213平均值温度实测值设定值误差T稳定性误差Tc5.4.4 检测器性能测试5.4.4.1基线漂移和基线噪声的测试5.4.4.1.1 测试条件 检测波长：254nm；流动相：水；流速：1.0ml/min；色谱柱：4.6mm250mm，C18，5m。5.4.4.1.2测试按不同的仪器配

9、置，设定检测器的灵敏度为较灵敏值。待系统平衡后，调整基线在图谱的中部位置，记录基线30分钟。以图谱显示的刻度值或灵敏度与积分仪的匹配关系，计算基线噪声和漂移值。基线噪声为峰峰噪声，选择最大的噪声作为基线噪声。计算法：基线噪声图谱单位距离对应的吸光度AU噪声峰峰间的垂直距离。漂移值为30分钟噪声的最高值和最低值之间垂直距离L对应的吸光度AU。计算法：漂移值图谱单位距离对应的吸光度AUL/0.5h。5.4.4.2 波长准确度的测试5.4.4.2.1 DAD/PDA的测试取咖啡因标样2)进样，记录色谱图和200nm400nm围的紫外吸收图谱，其205nm处的最大吸收处波长与205nm比较，其273n

10、m处的最大吸收处波长与273nm比较，最小吸收处的波长与245nm比较，三波长处的差值|均应2nm。5.4.4.2.2 UV检测器的测试a.具备紫外图谱扫描功能的检测器：以水流过流通池时作一空白扫描，然后，以手动式将咖啡因标样2)注入流通池，扫描200nm300nm围的紫外吸收图谱。记录咖啡因最大吸收和最小吸收处的波长，其205nm处的最大吸收波长与205nm比较，其273nm处的最大吸收波长与273nm比较， 最小吸收波长与245nm比较，三波长处的差值|均应2nm。b.不具备紫外图谱扫描功能的检测器：以水注入流通池调零，然后，将咖啡因标样2)注入流通池，通过设定不同波长，记录205nm、2

11、45nm、273nm三个波长上下各5个nm围的吸收度A或流通池参比能量R与样品能量S的比值，205nm、273nm波长处各取该波长围最大的吸收值或比值对应的波长为测定波长；245nm波长处取该波长围最小的吸收值或比值对应的波长为测定波长。测定波长分别与对应的波长205nm、245nm、273nm比较，三波长处的差值|均应2nm。5.4.4.2.3 线性测试a测试条件流速：1.5ml/min； 流动相：水-乙腈=85：15； 检测波长：273nm；色谱柱：4.6mm250mm，C18，5m。b测试待系统平衡后， 分别取咖啡因标样1)、2)、3)、4)、5)、6)，手动进样器依仪器配置之定量环的体

12、积进样，记录色谱图。以标样浓度Ci为横坐标，以咖啡因峰面积Ai为纵坐标作线性回归，得其线性程及相关系数R。对各标样浓度的响应因子fi进行数理统计，按公式（3）计算其RSD。其中fi =Ci/Ai。5.4.5 进样器性能测试5.4.5.1 定性、定量重复性的测试a.测试条件流速：1.5ml/min；流动相：水-乙腈=85：15；检测波长：273nm；色谱柱：4.6mm250mm，C18，5m。b.测试取咖啡因标样5)（浓度为0.125mg/ml），自动进样器以5l，10l，20l的体积各连续进样6次；手动进样器依仪器配置之定量环的体积连续进样6次，记录色谱图，以咖啡因峰的保留时间和峰面积，按公式

13、(3)计算相对标准偏差 RSD，并以下表所列容记录测试数据和结果。表8 定性、定量重复性的测试进样体积次数n123456平均值RSD保留时间(min)峰面积5.4.5.2 线性测试a测试条件流速：1.5ml/min； 流动相：水-乙腈=85：15； 检测波长：273nm；色谱柱：4.6mm250mm，C18，5m。b测试取咖啡因标样3)（浓度为0.025mg/ml），分别以5l，10l，15l，20l，25l的体积进样，记录色谱图。以进样体积V i为横坐标，以咖啡因峰面积Ai为纵坐标作线性回归，得其线性程及相关系数R。对各进样体积对应的响应因子fi进行数理统计，按公式（3）计算其RSD。其中f

14、i =Vi/Ai。 5.4.6 梯度组成测试5.4.6.1 测试条件流速： 2.0ml/min；流动相1：水；流动相2： 0.5% 丙酮的水溶液；检测波长：265nm；色谱柱：限流阻尼管。5.4.6.2 测试以限流阻尼管替代色谱柱，以流动相1平衡系统，通道A、B匹配（或通道C、D匹配），按下表之梯度程序，平行测试3次，记录色谱图。将色谱图按0%到100%B（或D）重新标定刻度，以测定每个梯级的理论高度（TSH）与实测高度（MSH），见图1“梯度组成准确度示意图”，其差值（TSH-MSH）即为准确度，以%B（或D）单位表示。取3次测定中50.0%B、6.0%B和5.0%B（或D）等值的准确度进行

15、数理统计，计算其准确度的精密度SD。表9 梯度测试程序表时间(分)%通道A(或C)：流动相1%通道 B (或 D) ：流动相21.001000.01.010.01006.000.01006.0110.090.09.0010.090.09.0111.089.012.0011.089.012.0149.051.016.0049.051.016.0150.050.019.0050.050.019.0194.06.023.0094.06.023.0195.05.026.0095.05.026.01100.00.0图1 梯度组成准确度示意图5.5 计算公式SS=(Fm-Fs)/Fs100% (1)SR=

16、(Fmax-Fmin)/ F100% (2)其中：Fm=10.060/t为流量实测值(ml/min) t ：收集流动相的时间(秒)Fs ，Fmax，Fmin，F ：分别为同一组测量中流量设定值、流量最大值、最小值、平均值(ml/min)RSD=100% (3)SD= (4)5.6 结果及结论每台HPLC校验完毕，由QC主管对校验记录和结果进行复核，无误后，依据该HPLC的配置，发出校验报告，并交领导审核。6、参考资料References：无。7、相关文件和记录Documents and Records：无。8、变更 / 修订记录Changes / revision records：文件编号Document No.生效日期Effective date变更/修订的原因、依据及详细变更容Cause of changes/revisions, basis and detailed change contentsSOP-LOP-790-8/002012.02.07新订文件(以下为空白) (The following is blank)