坛紫菜的分类学研究Word文件下载.docx

1、5.8S rDNA长度为158bp，该区域的5端和3端十分保守，在紫菜属中差异较小；ITS1的长度为334bp；ITS2为678bp。已经测定IGS区的部分长度为3555bp，该区域存在复杂二级结构。通过对坛紫菜核糖体基因簇序列的分析表明，其能够成为紫菜分类鉴定与系统演化的分子标记。关键词：坛紫菜；核糖体；顺反子；系统演化The nuclear ribosomal DNA （nrDNA） cistron sequence of Pyropia haitanensis （Bangiales, Rhodophyta）Hao Zhang, Yuan He, Songdong ShenSchool o

2、f Biology and Basic Medical Sciences, Soochow University, Suzhou 215123, ChinaAbstract: Pyropia haitanensis is a unique cultivated laver in China, while the lack of effective molecular idenfitication technology affects the taxonomy of P. haitanensis. The study sequenced the nuclear ribosomal DNA （nr

3、DNA） cistron sequence of P. haitanensis from Putian, Fujiang Province by polymerase chain reaction （PCR）, in order to provide molecular biological evidience for classification and germplasm identification of P. haitanensis. Results shown that each unit is composed of the small-subunit （SSU） rRNA gen

4、e of which the full length is 2953bp; the partial sequence of the large-subunit （LSU） rRNA gene of which the length is 3603bp without any introns; the length of the 5.8S rRNA gene is 158bp, the 5 and 3 terminal sequences of the genic regions of the ribosomal cistron are extremely conservative among

5、genus of Pyropia; the length of ITS1 is 334bp and ITS2 is 678bp; the partial sequence of IGS is 3555bp, due to a complicated secondary structure exsits in IGS region makes sequencing untoward. Though the analysis of nuclear ribosomal DNA sequence, it can be a molecular maker for the taxonomic identi

6、fication of Pyropia.Keywords Pyropia haitanensis; ribosome; cistron; system evolution引言紫菜广泛分布于世界各地，自然生长的紫菜数量十分有限，因此目前用作食用以及研究的紫菜主要是通过人工养殖，我国紫菜产量居世界首位，紫菜已成为重要的经济海藻之一1。坛紫菜（Pyropia haitanensis）隶属于红藻门（Rhodophyphyta），原红藻纲（Protoflorideophyceae），红毛菜目（Bangiales），红毛菜科（Bangiaceae），紫菜属（Pyropia），原产于福建的平潭、莆田、惠安等

7、地，系暖温性海藻，是我国特有的也是主要的栽培品种之一，其产量约占全国紫菜产量的75%，是具有重要经济价值的红藻2。坛紫菜生物学特征类似于红藻门中的其他紫菜，具有异形世代交替的生活史，包括大型的叶状体和小型的丝状体两个阶段，叶状体阶段是作为食用的阶段，而对于种质保存则以丝状体阶段为主3。对叶状体的形态学描述通常作为区分不同紫菜属的经典分类方式，实际分类中，研究者更倾向于根据地理位置和其他的一些环境条件来进行区分，因此缺乏一些稳定的分类特性是区分紫菜属的一个巨大障碍4。随着基础研究的加强，坛紫菜的育种及栽培技术得到了显著提高，但其种质资源的研究暴露出了很大问题，缺乏科学有效的种质鉴定技术严重影响了

8、坛紫菜的良种选育和广泛推广，因此开发一些有效的种质鉴定技术变得非常重要5。近年来，分子生物学技术得到了快速发展，越来越多的研究倾向于采用分子生物学方法结合传统细胞生物学等方法来对紫菜属进行分类，这使得分类鉴定工作变得更为精确和高效。在海藻的分子生物学层面的分类研究中，核糖体DNA被越来越多的关注6-8。核糖体RNA基因（rDNA）是植物界最保守的基因之一9，由高度串联的重复序列构成，且拥有转录活性的多基因家族，它以成簇的方式储存在一条或者多条染色体的核仁区。真核生物的rRNA包括基因内间隔区（IGS），18S rDNA（SSU），内转录间隔区1（ITS1），5.8S rDNA， 内转录间隔区2

9、（ITS2）和28S rDNA（LSU），其中18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA顺序串联，构成了一个转录单位，又称顺反子（cistron）。18S、5.8S、28S被两个内转录间隔区（ITS）1和2分隔开来。而转录单位之间又被基因内间隔区（IGS）分隔开，IGS则包含一个非转录间隔区（NTS）以及一个外转录间隔区（ETS）。核仁区有很多这样的串联重复单元，这些重复单元的进化趋于同步，可称之为协同进化，从而使转录单元在同一种群间保持同质性10-11。然而同一重复单元的不同区域由于具有不同的功能，导致进化速率存在差异，研究人员运用进化速率较慢相对来说较为保守的18s rDNA和

10、28s rDNA作为区分紫菜种上的分子标记12，而进化速率略快的ITS区则结合5.8s rDNA用来对紫菜种间进行区分13-14，IGS区则是高度可变区，是一种较为灵敏的分子标记，已经应用于紫菜种下的分类鉴定工作中15-16。本文选取福建莆田的坛紫菜作为实验材料，测定其核糖体RNA基因，得到了大部分的基因簇序列，为紫菜属的系统进化、分类鉴定提供有价值的信息，另外本文获取坛紫菜核糖体基因簇序列的方法也可为今后获取其他红藻的序列提供重要的参考信息。图1. 核糖体DNA重复单元的基本结构图Figure 1. Schematic diagram of the tandem repeated ribos

11、omal DNA1材料与方法1.1 实验材料本实验使用坛紫菜叶状体于2012年采自福建莆田栽培海区筏架，阴干后，放置于-20保存。1.2 研究方法1.2.1 DNA提取将样品放入消毒海水中复苏，挑取健康完整叶状体，超纯水清洗3次，吸水纸吸去藻体表面水分。将混合的叶状体和单个的叶状体叶片分别置于研钵中，经液氮充分研磨成粉末状。采用CTAB法17进行DNA的提取:加入适量60水浴的CTAB裂解提取液，充分混匀。将600L混匀的液体分别转移到1.5ml的Eppendorf 管中，60温浴3个小时。取出样品，分别向每管中加入1/3体积的5mol/L 醋酸钾，和样品等体积的氯仿：异戊醇（24:1），振荡

12、充分混匀，至溶液无分层现象。8000rpm，离心15min，将上清液移至新管，加入2/3体积的异丙醇，上下混匀，13000rpm，4，离心20min，沉淀DNA。用70%的乙醇清洗沉淀1-2次，沉淀在无菌风下吹干后溶于400L 1TE缓冲液中。沉淀完全溶解后，重复氯仿：1）的抽提步骤。在上清液中加入两倍体积的无水乙醇，上下混匀，13000rpm，4，离心20min，沉淀DNA。沉淀在无菌风下吹干后溶于50L 0.1TE缓冲液中备用。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。1.2.2 引物的设计及PCR 扩增各个区段的引物序列及位置如表1所示。由于IGS有复杂结构，因此设计了多对引物进行扩增。利用

13、提取的福建莆田坛紫菜DNA作为模板，所用50L的PCR反应体系中含有5L模板DNA，5L dNTP Mixture（2.5mmol/L each），上下游引物（20mol/L）各1L，5L 10LA PCR Buffer（Mg2+plus），0.3L Taq（5U/L），32.7L ddH2O。PCR条件如表2。表1：PCR的引物Table 1: Primers used for PCRRegionPrimersSequence（5-3）Source of primerSSUSSUFCAACCTGGTTGATCCTGCCAGT18S: 1-22 （GenBank No. AB013177）SS

14、URAATGATCCTTCCGCAGGTTCAC 2328-2349 （GenBank No. AB013177）LSULSUFCCATAACGCATCAGGTCC28S: 1937-1954 （GenBank No.JQ236860）LSURCGTCAATGAGGCGAGAAAIGS: 1505-1522ITSITS1FTCGCTCCTACCGATTGAATG李艳燕（2010）ITS1RCTCCTATTAGCGGGCACTIGSITS2FTCGCAACGATGAAGAACGITS2RTAAGTTCAGCGGGTGGTCIGS1FTGCTGGAATGGACGATAAIGS1RAGCCATTCG

15、CAGTTTCACIGS2FCTTCTGGATGCGGGACGAGTAA 1895-1916 （GenBank No.JQ236860）IGS2RCCCAAGGTATGTATGCGAGGTA 326-347 （GenBank No.JN983469）IGS3FIGS3R表2：扩增不同区域时的PCR条件Table 2. PCR reaction profiles for amplifying regions of the ribosomal unitSSUF/RLSUF/RITS1F/RITS2F/R 95 3 min 94 5min 94 5 min 94 30 s 94 1min 98 10

16、 s 56 30 s 55 30 s 55 1min 52 1min 72 3 min 72 2 min 72 1.5min 72 1 min - 35cycles - 35 cycles - 35 cycles 72 7 min 72 10 minIGS1F/RIGS2F/RIGS3F/R 60 30 s 72 7 min 72 2min - 45 cycles - 30 cycles1.2.3 PCR产物的克隆及测序将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收得到的目的片段与克隆载体pEASY-T3 于25连接10min，重组质粒转入Trans1-T1 感受态细胞中，在含有IPTG、X-gal

17、、Amp+的LB平板上培养过夜。挑取白色单菌落于LB培养液中，37摇菌过夜，抽提质粒，使用质粒PCR的方法鉴定阳性重组子。每个平板至少挑取3个阳性克隆送往苏州金唯智生物技术有限公司测序。 A B C图2. 引物扩增电泳图Figue 2. Gel electropherogram of PCR amplification products.M为Takara DL5000 DNA marker图A为IGS扩增条带，条带1-3分别为引物IGS1F/R, IGS2F/R, IGS3F/R扩增的条带；图B为引物SSUF/R扩增得到的SSU rDNA条带；图C为引物LSUF/R扩增得到的LSU rDNA条

18、带。1.2.4 序列分析比对及拼接 利用NCBI服务器上的BLAST软件对测序结果进行同源性检测18，用MegaBlast对得到的序列进行对齐来确定坛紫菜各区域比对的长度及边界，并利用DNAMAN进行多重序列比对。2结果2.1 SSU rDNA序列通过对坛紫菜不同个体的PCR扩增得到了SSU rDNA的长度为2953bp，与GenBank中已有的坛紫菜SSU rDNA序列（JN104583.1）的同源性为99%，覆盖率为79%，和另一序列（AB015795）的同源性为99%，覆盖率为78%。序列如下：CAACCTGGTTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTA

19、AGCCATGCATGTCTAAGTATAAACACTTTTATACACGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAAACAGTTATAGTTCCTTTGAGAACCACACTACTTGGATAACCGTAGTAATTCTAGAGCTAATACATGCCGCAACGCCCGACTCACGAAGGGTGGTATTTATTGGATAAAAAGCCATCGTGCTCCTTCCAGAGCGCTTTGAGATGATTCACAATAACTTGTCGGATCGCATGGCCTTGTGCTGGCGACTGCTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGAGTATTGGTCTAC

20、CATGGTGTCGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACTCGGGGAGGTAGTGACAAAAAATAACAATAGGGGGCCCTTTGGGCCTTCTAATTGGAATGAGAACAATTTAAATCCCTTATCGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGAACCTAGTTCCACTCGTTGCTCGCCTCGTGCTGTGATTGCATATGCACAGGCGCACCGCGTGAAGCGTCAAGCCCTCGT

21、TAAAATAAAACAGCGCCAGATGTCTCTTTCCGGAAGCAGGGTGACTTGTGGAAGGCAAGCAGGCAAAAGATGGGAACCTATTTTCTTTTGGGAAAATCAATGAGCCCCCATCATACACTTCTAAATTGTCGGGGAGTGCCCGCCAAGCCTTTGACTACCGCGGTCCGCCGAGAGATGAGAGCGAGCAATCGTTCAGGACGCAGCAGTGTACGTAGTGGTACATGGATGGTAAAAACGTCAAGGGTAGGGTTGATCCGCAGGGAAGCGCGAGTGCTTCTGTCATTTGGCCTTTTGGTGGCC

22、GCGTGGCGAGATGCAAAGGCGAACCTTCAGAGACTCTAATGGAGTGGGCGCAAGCTTAAGGGAGAGTCCAATCCACTGGGAAAAAAACCAGGTCCACAGGAGTAACGGGATTTTGCTCGCCCCGGAGGACTGTGGAAGGCGACCAAGCGTCTTAAGGGCGCAGCGTTGTCGGGTATGAATGGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAACGCTCGTAGTCGGACCTCGGAGCGCCCTCACGGGCCGGGCTTCTGCCCTTGTGCCAGTGG

23、GAGTTTGTCTCCTTTTGTCGGGACGCGGTGTGTGGGGCCTTGACTGGTTCCGCGCGTTTATACCTGCGGGCCGACCGTTTACTGTGAAGAAAGTAAAGTGTTCAAAGCAGGCCAATGCCTTGAATATGTGAGCATGGAATAATAGAATAGGACTTGGGCTCTATTTTGTTGGTTTCCAGTGACCAAGTAATGATTAATAGGGATGGTTGGGGGCATTCGTATTTCATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTGATGGAAGACGTACAACTGCGAAAGCATCTGCCATGGATGTTTTCATTG

24、ATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACGATGCCGACTGGGGATTGGCGGGGCTTCTAATTCATGTCCACGTCAGCACCCTAAGGGAAACCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCGGACAGAAGTATGATTGACAGACTGAAAGCTCTTTCTTGATTTTTTGGT

25、TGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTCGTCCTGCTAAATAGGTGCGCGCATGCCAGCACTGCGTTCTTACCTTCTTAGAGGGACTATGCGCGTCTAGCGTATGGAAGATTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGATGCATTCAACGAGTTTCACTTGATAGTCCTGGGTCGGAAGGCTCGGGTAATCTTTTGAAAGTGCATCGTGCTGGGGATAGATCATTG

26、CAATTTTTGATCTTAAACGAGGAATTCCTTGTAGGCGCAGGTCATCAGCCTGCGCCGAATACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGAATGGTCCGATGAAATGTCCGGATCGTGGCTACTGTGATGGACTCTGTCCAGAGCGGCAGCCGTGAGAAGCTCATTAAATCTTATCATTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTATTTTGTGGATGGACACCCCGACGGGTGGTCCTTCCGTAGGAAAACGTACACGAAGCCTTTGCAGCCCGAAAG

27、GGTGCACAGGACGCGACTAGGAAAAAAAGGATTCTGTGGTCAATGCAAGCGGCGGCCACCGCCCCCCCCCCCACCTCGCCGAGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGAGGGACAGCTGCGACTTTCTCAAATTGCGGGAACACCCTAAAGTCAGCAAACACCGCGGCTTGGCGCGAAAAGCGCCAGGCGCAGCAGTCGGGGTAGCGCCCTGACGGATGGTAATAGCCTTTGTTGAATGGAACAATGGGCAATCCGCAGCCAAGCCCCTAAGGCCCCTCGCGGCTATGGGGAAGGTTCACAGACT

28、GTAAGGGAAGGGGTTTTTCTGCTATGAAGAGCTTAAGAGACAGTCGGTCCCCTGCGAAAGCAGAGTCTCATGTGAGGAAGGCGCCCAGGAAAAAGTGGGTGCTGGAGAGCCATGGGAGCCCTTTCTCGTTCGGGGGGGGGGCGGGGAGTTTTCCAAGACGAGAAAAATAATACACGTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT GenBank中已有长度为2334bp，本研究将其延伸了619bp，得到了全长序列。2.2 LSU rDNA序列获得LSU rDNA的长度为3603bp，和GenBank中已有的坛紫菜L

29、SU rDNA序列（JQ236860.1）的同源性为100%，覆盖率为55%，和和另一序列（JN104581.1）的同源性为100%，覆盖率为32%，因此得到的序列为坛紫菜LSU rDNA的部分序列：CGGAGGATAAGAAACTAAAAAGGATTCCCTCAGTAGCGGCGAGCGAAGCGGGAAAAGCTCAACATGAAAACCGGTAGGGGTACACCCCCCCCTGACCGGGTTGTAGGGTAAAGTGGTGTCGTCAGTGTCGAGTCGGATATAAATCCCGTTTGGAATGGGGTGTCATAGAGGGTGATAACCCGTCTTGATCCGACATGCCGATGCGTTACGATGACCTTACAAAGAGTCGGGTTG