核酸与核苷类药物.ppt

1、第第 12 章章 核酸与核苷类药物核酸与核苷类药物第一节第一节 概述概述一、核酸与核苷类药物一、核酸与核苷类药物核酸与核苷类药物是指具有药用价值的核酸、核核酸与核苷类药物是指具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷或者碱基苷酸、核苷或者碱基天然的、类似物、衍生物及其聚合物天然的、类似物、衍生物及其聚合物作用：作用：影响生物的蛋白质合成和脂肪、糖类的代谢影响生物的蛋白质合成和脂肪、糖类的代谢恢复正常代谢或干扰某些异常代谢恢复正常代谢或干扰某些异常代谢用途：放射病、血小板减少症、白细胞减少症、用途：放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎缩、肿瘤、病急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎

2、缩、肿瘤、病毒病毒病 核酸类物质药物一般可分为两大类：核酸类物质药物一般可分为两大类：一类具天然结构的核酸类物质，一类具天然结构的核酸类物质，另一类是自然结构碱基、核苷、核苷酸的结构另一类是自然结构碱基、核苷、核苷酸的结构类似物或聚合物。类似物或聚合物。前者是生物体合成原料或蛋白质、脂肪、糖生物合成前者是生物体合成原料或蛋白质、脂肪、糖生物合成与降解以及能量代谢的辅酶，这一类药物有助于改善机体与降解以及能量代谢的辅酶，这一类药物有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促使缺氧的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促使缺氧组织恢复正常生理机能，临床上已广泛使用于放射病、血组织

3、恢复正常生理机能，临床上已广泛使用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病、小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病、肌肉萎缩等病症的治疗，包括肌苷、辅酶肌肉萎缩等病症的治疗，包括肌苷、辅酶A、GTP、CTP、UTP、ATP、腺苷、辅酶腺苷、辅酶I、辅酶辅酶等，多数是生物体自身等，多数是生物体自身能够合成的物质，具有一定临床功能，毒副作用小，基本能够合成的物质，具有一定临床功能，毒副作用小，基本都可经微生物发酵或从生物资源中提取。都可经微生物发酵或从生物资源中提取。后一类药物是治疗病毒感染性疾病、肿瘤的重后一类药物是治疗病毒感染性疾病、肿瘤的重要手段，也是产生干扰素

4、、免疫抑制的临床药要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物。物。正式用于临床的抗病毒核苷类药物有三氮唑核正式用于临床的抗病毒核苷类药物有三氮唑核苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。珍奥核酸珍奥核酸DNA药物药物核苷类药物核苷类药物恩替卡韦 二、核酸与核苷的一般理化性质二、核酸与核苷的一般理化性质核糖（核糖脱氧核糖）核糖（核糖脱氧核糖）核糖（核糖脱氧核糖）核糖（核糖脱氧核糖）核苷核苷核苷核苷 嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）碱基碱基碱基碱基核酸核酸核酸核酸核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸 嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）嘧啶（胞、尿、胸腺

5、嘧啶）嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）（DNADNA、RNARNA）磷酸磷酸磷酸磷酸 DNADNA和和和和RNARNA是存在于细胞中的正常成分。是存在于细胞中的正常成分。是存在于细胞中的正常成分。是存在于细胞中的正常成分。DNADNA主要存在于细胞核中，少量（主要存在于细胞核中，少量（主要存在于细胞核中，少量（主要存在于细胞核中，少量（2%2%）存在于线粒体和叶绿体中；）存在于线粒体和叶绿体中；）存在于线粒体和叶绿体中；）存在于线粒体和叶绿体中；RNARNA主要存在于细胞质中，少量（主要存在于细胞质中，少量（主要存在于细胞质中，少量（主要存在于细胞质中，少量（10%10%）存在

6、于核仁、核浆和染色体中。）存在于核仁、核浆和染色体中。）存在于核仁、核浆和染色体中。）存在于核仁、核浆和染色体中。核核核核酸酸酸酸的的的的含含含含量量量量与与与与细细细细胞胞胞胞大大大大小小小小无无无无关关关关，以以以以生生生生长长长长旺旺旺旺盛盛盛盛的的的的组组组组织织织织细细细细胞胞胞胞中中中中含含含含量量量量较较较较多多多多，如如如如动动动动物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。第二节第二节 制备的一般过程与原理

7、制备的一般过程与原理一、一、RNARNA的提取与制备的提取与制备 l工业用工业用RNARNA的提取的提取 （1 1）RNARNA及及其其工工业业来来源源：从从微微生生物物中中提提取取RNARNA是是工工业业上上最最实实际际和和有有效效的的方方法法。一一些些最最常常见见的的菌菌体体含含有有丰丰富富的的核核酸酸资资源源，如如酵酵母母、白白地地霉霉、多多种种抗抗菌菌素素的的菌菌丝丝体体青青霉霉素素，制制霉霉菌菌素素等等菌体。菌体。通通常常在在细细菌菌中中RNARNA占占5 52525，在在酵酵母母中中占占2.72.71515，在霉菌中占，在霉菌中占0.7%0.7%2828。在菌体内RNA含量的变化受

8、培养基组成影响，其中关键是铵铵离离子子浓浓度度和和磷磷酸酸盐盐浓浓度度。培养酵母菌体收率高，易于提取RNA。很显然在许多酵母中，早早期期细细胞胞中中的的RNARNA含含量量高高，其确切数值取决于碳、氮比例碳、氮比例和培养基组成等。（2 2）高）高RNARNA含量酵母菌株的筛选含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛筛选选到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱诱变变育种育种的方法提高酵母菌的RNA含量。稀稀碱碱法法：是用氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液（1%1%），使使细细胞胞壁壁变变性性，使核核酸酸从从细细胞胞内内释释放放出出来来。需用酸中和PH7PH7。然后除除去去菌菌体体，将pH调至RNA的等等电电点点（p

9、H2.5pH2.5），使RNARNA沉沉淀淀出来。上法的缺点是制得的RNA M Mr r较较低低,(磷磷酸酸单单脂脂酶酶、磷磷酸酸二二脂脂酶酶降降解解RNARNA，90 90 保持保持3 34h4h破坏酶破坏酶)。浓浓盐盐法法：是用高高浓浓度度盐盐溶溶液液（6%6%8%8%）处理，同时加加热热，以改变细胞壁的通透性改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。核酸从细胞内释放出来。要避免分分子子降降解解，可采用苯苯酚酚法法制备RNARNA。用苯酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水溶液内含有全全部部RNARNA，可用乙乙醇醇沉沉淀淀出来。脱脱氧氧核核糖糖核核蛋蛋白白溶于浓浓盐盐溶溶液液1

10、mol/L1mol/L,不溶于0.14mol/0.14mol/L,而核核糖糖核核蛋蛋白白溶于0.14mol/L0.14mol/L盐溶液。（3 3）RNARNA的提取实例：的提取实例：啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份70%），加入230ml含NaOHNaOH 3g的水，20以下缓慢搅拌30分钟。用6molL HCl调至pH7，搅拌15分钟，离心得清液255m1。冷至1010以下，6molL HCl调pH2.5pH2.5，置冷过夜，离心得RNA l.8g（纯度80）。RNARNA提取实例：提取实例：提取提取 中和中和 HCl 酸化、沉淀酸化、沉淀HCl酵母酵母 提取

11、液提取液 上清液上清液 RNA NaOH、水水 pH 7、离心离心 pH 2.5、离心离心 二、二、DNADNA的提取与制备的提取与制备 l 工业用工业用DNADNA的提取的提取 取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状，加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至100100，保保温温1515分分钟钟，迅迅速速冷冷却却至至20202525，离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L35L含含热热变变性性DNADNA的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶酶法法降降解解生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA，在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积9595乙乙醇醇，离心可获得纤维状DNA，

12、沉沉淀淀用用乙乙醇醇、丙丙酮酮洗洗涤涤，减压低温干燥得DNA粗品，产品含热变性含热变性DNA50DNA506060。工业用工业用DNADNA的提取的提取 提取提取 热变性热变性 沉淀沉淀乙醇乙醇鱼精鱼精 提取液提取液 纤维状纤维状DNA 水、水、100 冷却、离心冷却、离心 70%-80%（无生物活性）（无生物活性）15min 干燥干燥 粗品粗品DNA（热变性后无活性）热变性后无活性）l 具有生物活性具有生物活性DNADNA的制备的制备 动物内脏（肝、脾、胸腺）加4 4倍倍重重量量生生理理盐盐水水经组组织织捣捣碎碎机机捣碎1分钟，匀浆于2500rpm离心30分钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3

13、次，每次洗后离心，将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，再捣碎3分钟，加加入入2 2倍倍量量5 5的的（用用45%45%乙乙醇醇作作溶溶剂剂）十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠，并搅拌23小时，在02500rpm离心，在上层液中加入等体积的冷冷9595乙乙醇醇，离心即可得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5 5十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠达110体积，搅搅拌拌1 1小小时时，经5000rpm离心1小时，清液中加加入入NaClNaCl达达1mol1molL L，再缓慢加入冷冷95%95%乙乙醇醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有生

14、物活性的DNA（活活性性DNADNA制制备备需需在在0 033操作）。操作）。l生物活性生物活性DNADNA的制备的制备 提取提取 洗涤洗涤3次次 5%SDS 动物内脏动物内脏 沉淀沉淀 沉淀沉淀 上层液上层液（肝、脾）（肝、脾）生理盐水生理盐水 生理盐水生理盐水 再捣碎再捣碎 离心、离心、30min 沉淀沉淀 洗涤、干燥洗涤、干燥 提取提取 纤维状纤维状DNA 粗品粗品DNA 上清液上清液 95%乙醇乙醇 冷乙醇、丙酮冷乙醇、丙酮 水、水、5%SDS 离心离心 沉淀沉淀 洗涤、干燥洗涤、干燥 DNA沉淀沉淀 活性活性DNANaCL、95%乙醇乙醇 乙醇、丙酮乙醇、丙酮三、用酶解法、发酵法和半

15、合成法制备核苷酸三、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 1 1、酶解法及碱水解法制备核苷酸、酶解法及碱水解法制备核苷酸l 酶解法制备脱氧核苷酸酶解法制备脱氧核苷酸 桔青霉桔青霉产生5-5-磷酸二脂酶磷酸二脂酶 红酵母红酵母产生3-3-磷酸二脂酶磷酸二脂酶 l 酶解法制备戊糖核苷酸酶解法制备戊糖核苷酸 我国从60年代开始使用核核酸酸酶酶P1P1降解核糖核酸生产单核苷酸，日本年产呈呈味味核核苷苷酸酸（肌肌苷苷酸酸和和鸟鸟苷苷酸酸）3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。酶解法生产酶解法生产55单核苷酸工艺流程单核苷酸工艺流程l双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I IG G）呈

16、呈味味核核苷苷酸酸的主要品种是肌肌苷苷酸酸钠钠和和鸟鸟苷苷酸酸钠钠，商品名简称为（I IG G），用核核酸酸酶酶PlPl降解RNA可获得GMPGMP和和AMPAMP，其中AMP经脱脱氨氨生成IMP。双酶法生产（I十G）工艺。l菌体自溶法生产核苷酸菌体自溶法生产核苷酸磷磷酸酸二二酯酯酶酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可产生5-5-核苷酸核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产5-核苷酸。（1 1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：l 碱水解法生产碱水解法生产2 2，3 3-混合核苷酸混合核苷酸 RNARNA结结构构中中的的磷磷酸酸二二酯酯键键对对于于碱碱性性条条件件不不稳稳定定，很很容容易易生生成成22，3 3 -环环状状磷磷酸酸酯酯，此此环环状状磷磷酸酸酯酯对对碱碱更更不不稳稳定定，很很易易加加水水分分解解生生成成2 2，3 3-混混合合核核苷苷酸酸。取RNA配成3 33.5%3.5%的水溶液，加氢氧化钠达0.3mol0.3molL L浓度，升温至3838，保保温温16162020小小时时，用6mol6molL L盐盐酸酸中中和和至至pH7.0pH7.0，