化验技术协会第七期培训资料文档格式.docx

1、 2.1.1.4 洁净级别及检查方法 通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法（参照医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。洁净级别尘粒数/m3浮游菌（个）/m3沉降菌（个）/（90mm0.5h）微粒直径0.5m微粒直径5m100级10000级100000级3,500350,0003,500,0000200020,00051005001310 沉降菌数测定（II法） 无菌室操作台消毒擦拭后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经3035预培养48h，证明无菌落生长），以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开

2、盖，暴露30min后将盖盖上。在3035培养箱内倒置培养48h，取出检查。3个平板生长的平均菌落数不超过1个。 有条件的单位，同时应检查无菌操作间和净化工作台上的浮游菌和尘粒数，分别应达到10000级和100级。如菌落数或尘粒数超标，应清洗过滤系统中的过滤器，必要时予以更换。 2.1.1.5 在每次操作前、后，用0.1苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。然后启动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。 2.1.2 阳性菌试验应另设单独的净化工作台，不得在供试品检验用的无菌室内或净化工作台上操作。 2.1.3 无菌室与洗刷、灭菌消毒、培养、结果观察及办公间等配套设施应相对集

3、中，布局合理，避免污染，便于管理。 2.2 仪器 2.2.1 恒温培养箱（3035）、生化培养箱（2025）、微波炉、匀浆仪（30008000rmin）或康氏振荡器、恒温水浴、电热干燥箱（250300）、电冰箱、离心机、离心管、0.45m滤膜及薄膜过滤器、蒸汽灭菌器（使用时要进行生物指示剂灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。 菌落计数器、显微镜（1500x）、电子天平或天平（感量0.1g），pH系列比色计。 2.2.2 玻璃器皿 锥形瓶（250300ml，内装玻璃珠若干；500ml，1000ml）、培养皿（直径9cm）、量筒（100ml，500m1）、试管（18mml80mm、28mml98

4、mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10m1分度0.1）、注射器（20ml或30ml等）、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）、不锈钢桶（带盖）。玻璃器皿用前应洗涤干净，吸管、量筒不挂水滴，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm适宜疏松的棉花，置吸管筒内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加硅胶塞或棉塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于高压蒸汽121灭菌30min，烘干或160干热灭菌2h，备用。 2.2.3 用具 大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用7075%乙醇溶液浸泡）。无菌衣、帽、

5、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。 接种环（白铱金或镍铬合金，环径45mm、长度610cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm）、实验记录纸等。 3 试液、稀释剂和试剂 3.1 试液 3.1.1 0.1苯扎溴铵溶液或其它适宜消毒液（供洗手、擦拭操作台面用）。 3.1.2 5石碳酸溶液或其他适宜消毒液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用）。 3.1.3 75乙醇溶液。 3.1.4 碘酊或碘伏溶液 3.2 稀释剂和试剂 稀释剂

6、配制后，高压蒸汽灭菌法灭菌。 3.2.1 0.9无菌氯化钠溶液 3.2.2 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 3.2.3 无菌聚山梨酯80氯化钠溶液 3.2.4 pH6.8无菌磷酸盐缓冲液 3.2.5 pH7.6无菌磷酸盐缓冲液按药典附录配制后，过滤，分装，灭菌。 3.2.6 0.1无菌氯化三苯四氮唑溶液（TTC） 3.2.7 pH7.2无菌磷酸盐缓冲液 4 培养基 4.1 营养琼脂培养基 4.2 玫瑰红钠琼脂培养基 4.3 酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基 培养基制备注意事项： 4.3.1 采用干燥培养基，按说明配制，应对灭菌后的培养基pH值进行校验。若为自配培养基，原料应挑选，琼脂

7、凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量。试剂规格应为化学纯以上。 4.3.2 配制的培养基不应有沉淀。如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。 4.3.3 培养基的分装量不得超过容器的23，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，松动或脱落造成染菌。 4.3.4 培养基配制后应在2h内灭菌，避免细菌繁殖。 4.3.5 灭菌后的培养基应保存在2-25，防止被污染，可在三周内用毕；保存于密闭容器中，可在一年内使用。制备好的培养基放置时间不宜过长，以免水分散失及染菌。 4.3.6 用水浴或微波炉加热溶化琼脂培养基，勿用电炉直接溶化琼脂培养基，以免营养成分过度受热而破坏。已溶化的培养基应一次用完，剩余培养

8、基不宜再用。培养基不能反复加热溶化。5 供试品抽样、保存及检验量 5.1 抽样 511 一般采用随机抽样方法，其抽样量应为检验用量（2个以上最小包装单位）的35倍量（以备复试或留样观察）。 5.1.2 抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品。机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。 5.1.3 凡药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。 5.2 保存 5.2.1 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内的污染菌因保存条件不妥导致死亡，损伤或繁殖。 5.2.2 供试品在检验之前，应保持原包装状态，严

9、禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。5.3 检验量5.3.1 所有剂型的检验量均需取自2个以上包装单位（中药蜜丸需取自4丸、膜剂取4片以上）。5.3.2 固体及半固体（黏稠性供试品）制剂检验量为10g。 5.3.3 液体制剂检验量为10ml。 5.3.4 膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为25cm2（中药膜剂较厚，不宜取量过多），化学药及生化药膜剂检验量为50cm2。 5.3.5 特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减。除另有规定外，口服固体制剂不低于3g，液体制剂采用原液者不得少于6ml，采用供试液者不得少于3ml，外用药品不得少于5g。 5.3.6 要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增

10、加10g或10ml。 6 试验准备 6.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1ml、10m1）、量筒、稀释剂等经传递窗移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先做好计划，准备足够用量，避免操作中出入无菌间。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。 6.2 开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30min。 6.3 关闭紫外杀菌灯后，操作人员用肥皂洗手，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。 6.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的

11、手术镊或剪将供试品启封。 7 供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。如使用了乳化剂、分散剂、中和剂或灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。供试液的制备若需用水浴加温时，温度不应超过45，30min。除另有规定外，常用的供试品制备方法如下： 7.1 液体供试品 取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至lOOml。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。 7.2 固体、半固体或黏稠液供试品 取供试品1

12、0g，加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪（30005000rmin、24min）或其他有效的方法，混匀，作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。蜜丸等需剪碎，放入匀浆杯。 7.3 非水溶性供试品 7.3.1 软膏、乳膏剂 先将已备妥灭菌的含司盘80 5g、单硬脂酸甘油脂3g、聚山梨脂80 10g的混合物融化，待冷至45时，加入供试品5g（或5m1），立即用玻棒搅拌均匀，分次少量慢慢加入45的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：20供试液。 7.3.2 油剂 取供试品10ml，加入无菌聚山梨

13、酯80 58ml，摇匀，再加入pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml。 7.3.3 栓剂 称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，置45水浴保温10min，使溶，加入无菌聚山梨酯80 58ml，振摇使之乳化，再加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（稀释剂和聚山梨酯80总量为100m1），摇匀。 7.3.4 眼膏剂 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法选用孔径为0.22m的脂溶性滤膜，以薄膜过滤法过滤除菌。滤器在140干热灭菌2小时，或用集菌仪除菌和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入4

14、5的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100ml，振摇510min，萃取，待油水明显分层，取其水层作为供试液。 7.4 非水溶性膜剂供试品 化学药膜剂一般取样为100cm2，置灭菌锥形瓶中，加入适量的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，于451水浴中保温，浸泡，振摇，以供试品浸液作为供试液。中药膜剂取50cm2，剪碎，加适量的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（通常lcm2加1m1或2ml），浸泡，振摇，以供试品浸液作为供试液。 7.5 肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10g，肠溶制剂加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液至100ml，结肠溶制剂加pH7.6无菌磷酸盐缓冲液至100ml，均置45水浴中，振摇，

15、使溶解，作为供试液。 7.6 气雾剂、喷雾剂供试品 取规定量供试品，置冰箱冰冻室内约lh。取出，速消毒供试品的开启部位周围，用无菌钢锥在容器上消毒部位钻一小孔，在室温轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1：10的供试液。 7.7 茶剂 取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100ml，振摇23min，以灭菌纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1：10加稀释剂，浸泡30min）。 以上供试品如吸水膨胀，或黏度过高，可

16、增加稀释剂的量，制成1：201：100供试液。 7.8 具抑菌活性的供试品 当供试品具有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下： 7.8.1 稀释法 取规定量的供试液，加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。用平板法测定菌数时，lml供试液可等量分注多个平皿；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。培养基稀释法适用于抑菌作用不强的制剂。 7.8.2 离心沉淀集菌法 取规定量的供试液，3000rmin，离心20min，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量。如供试液中有不溶颗粒、沉淀，先以500rmin，离心5min，留离心沉淀物，

17、取全部上清液按上述高速再离心，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量。 7.8.3 薄膜过滤法 见细菌、霉菌和酵母菌计数10.2。 7.8.4 中和法 凡含汞、砷或防腐剂等的供试品，可用相应的试剂钝化、中和其抑菌活性，制成供试液。 8供试液的稀释（10倍递增稀释法） 8.1 取34支灭菌试管，分别加入9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。加稀释剂后，试管塞应立即塞上。 8.2 另取1支1ml灭菌吸管吸1：10均匀供试液1ml，加入装有9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中，（此时操作一般为：左手执试管并将塞打开，倾斜，右手执10ml吸管吸量。切勿在乙醇灯焰峰的正上方操作，以免灯

18、焰将供试液中的菌细胞杀灭）混匀，即1：以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1：103、1：104等适宜稀释级（34）。每递增1稀释级，必须另换一支吸管。在作10倍递增稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁，调整液量至刻度，吸管移至第2级稀释管的内壁近液面处（勿接触液面），缓慢地放出全部供试液（吸管内应无粘附或残留液体），然后将吸管放入消毒液缸内。9 计数方法验证由于某些供试品具有抗菌活性，在建立测定方法或原测定法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠

19、性进行验证。验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法进行。对各试验菌的回收率逐一进行验证。 9.1 验证用菌株 大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B）44102，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）26003，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63501，白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F）98001，黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98003。 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，白色念珠菌的新鲜

20、培养物至改良马丁培养基中，培养1824h；黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基，培养5-7天。用09无菌氯化钠溶液制成每lml含5001000个cfu的菌悬液。 9.2 验证方法 验证试验分四组，至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算供试品组和对照组试验的菌回收率。 9.2.1 试验组 取最低稀释级的供试液，按每1ml供试液加入50lOOcfu试验菌，按菌落计数方法测定其菌数。平皿法计数时，取试验菌液、供试液lml分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基；薄膜过滤法计数时，取供试液2ml过滤，冲洗液冲洗，并在最后一次的冲洗液中加入试验菌。 9.2.2 菌液组 取上述试验菌液，测定其加入的试验

21、菌菌数。 9.2.3 供试品对照组 取最低稀释级的供试液1ml，按菌落计数方法测定其所含菌数。 924 稀释剂对照组 为考察供试液制备过程对微生物的影响程度，可用相应的稀释液替代供试液，加入试验菌，使最终菌浓度为每lml含50lOOcfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。 试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数试验组的菌回收率（）=100% 菌液组的平均菌落数 稀释剂对照组的平均菌落数9.2.6稀释剂对照组的菌回收率（）= 菌落组的平均菌落数 9.3 结果判定 稀释剂对照组的菌回收率均应不低于70。若试验组的菌回收率均不低于70，则可按该供试液制备方法和菌落计数法测定供试品

22、的细菌、霉菌或酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70，应建立新的方法，消除供试品的抑菌活性，并重新验证。 9.4 验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。 9.5 注意事项 9.5.1 所用标准菌种的传代次数不得超过5代。以冷冻干燥的原始菌种开启后转种培养，其培养物为第一代。 9.5.2 黑曲霉菌的菌液制备 将黑曲霉菌的孢子接种至真菌琼脂斜面培养基上，于2025培养57天，使大量的孢子产生。加入35ml的0.9无菌氯化钠溶液，用无菌玻棒或接种环轻轻将孢子洗脱。然后，用一支10m无菌球形毛细吸管，其管口用无菌棉花或纱布包扎且能过滤菌丝的装置，吸出孢子菌液至无菌试管内，用比浊

23、法，将菌液稀释至每毫升含10lOOcfu。 9.5.3 做试验菌的回收率试验时，加入菌量以50100cfu为宜。加菌量过多，如薄膜法，菌落拥挤，则不好计数；加菌量过少，如小于30个，则误差大。 10 检查法10.1平皿法 10.1.1 在上述进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取该稀释级供试液各1ml至每个直径90mm的灭菌平皿中，或从高稀释级至低稀释级吸液时可用1支吸管吸供试液各lml至每个灭菌平皿中。每一稀释级每种培养基至少注23个平皿（一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注皿时，将lml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。一般取适宜的连续23个稀

24、释级的供试液进行细菌、霉菌和酵母菌数测定。 10.1.2 阴性对照 待各级稀释液注皿完毕后，用1支lml吸管吸取稀释剂（pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）各lml，分别注入4个平皿中。其中2个作细菌数阴性对照，另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照。 10.1.3倾注培养基 将预先配制好的细菌计数用的营养琼脂培养基；霉菌、酵母菌计数用的玫瑰红钠琼脂培养基；含蜂蜜、王浆液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌）和YPD琼脂培养基（酵母菌）溶化，冷至约45时，倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或逆时针方向快速旋转平皿，使供试液或稀释液与培养

25、基混匀，置操作平台上待凝。在旋转平皿时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上。 10.1.4 培养 一般细菌计数平板倒置于3035培养箱中培养48h。霉菌、酵母菌计数平板倒置于2025培养箱中培养72h。 10.1.5 菌落计数 10.1.5.1 一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡、油滴等的鉴别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察，或挑取可疑物涂片镜检。 10.1.5.2 供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点计在细菌、霉菌和酵母

26、菌数内。排除的方法需按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。 10.1.5.3 供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多的有形物，且难与菌落相鉴别。为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿（12个平皿），注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。或用0.001TTC营养琼脂注皿，经培养后该培养基生长的菌落为红色，衬于白色背景上易于点计细菌菌落和区分其他有形物。有些软膏等非水溶性供试品，经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，为防止这种情况，也可用0.001TTC营养琼脂注皿

27、。 10.1.5.4 若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个或2个以上菌落计数；若平板生长有链状或片状、云雾状菌落，菌落间无明显界线时，一条链、片作为一个菌落计，但若链、片上出现性状与链（片）状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延的较大的片状菌落或花斑样菌落，其外缘有若干性状相似的单个菌落，一般不宜作为计数用。 10.1.5.5 若各稀释级2个平板菌落的平均数在15以上，同稀释级二平板菌落数相差1倍时，该稀释级菌落数不得作为计数依据；当2个平板菌落均数在15（含15）以下时，两个平板菌落数的差值允许范围为04，17，29，310，412，514，615，717，818

28、，919，1020。超出以上范围即视为操作误差，不得作为计数依据。 10.1.5.6 菌落生长呈蔓延趋势者，细菌，霉菌需逐日作初步点计，在点计霉菌菌落时，轻翻转平板，勿反复翻转，否则使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，导致计数误差。 10.1.5.7 在48h点计细菌，72h点计霉菌时，如菌落极小，不易辨认，可延长培养时间57天，再点计菌落数。 10.1.5.8 对有疑议的供试品以YPD培养基作酵母菌计数时，可培养至1周再点计菌落数。 10.1.5.9 含蜂蜜、王浆液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基点计霉菌数，YPD琼脂培养基点计酵母菌数。两者计数值合并报告。 10.1.5.10 在特殊情况下，若营养琼脂培养基上生长有霉菌和酵母菌其数量多于玫瑰红钠琼脂培养基上生长的霉菌和酵母菌，或玫瑰红钠琼脂培养基上生长的细菌数多于营养琼脂培养基上生长的细菌数，以菌落数多的培养基中的菌数报告结果。 10.1.6 菌数报告规则 宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30300之间、霉菌平均菌落数在30100之间的稀释级，作为菌数报告的依据。 10.1.6.1 当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。 10.1.6