碱性磷酸酶km值测定实验报告Word文件下载.docx

1、凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。非竞争性抑制剂的作用特点是不影响s与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。本实验选取na2hpo4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。实验步骤：实验一:底物浓度对酶促反应速度的影响1.取试管9支，将0.01mol/L基质液稀释成下列不同浓度：管号试剂2.另取9支试管编号，做酶促反应：3.混匀，37水浴保温5分钟左右。4.加

2、入酶液后立即计时，各管混匀后在37准确保温15分钟。5.保温结束，立即加入0.5mol/Lnaoh1.0ml以中止反应。各管分别加入0.3%4-氨基安替比林1.0ml及0.5铁氰化钾2.0ml。6.充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510nm处比色。读取各管吸光度，做记录。（酶活性计算及Km值计算）实验计算：1.在37c下保温15分钟产生1mg酚为1个酶活性单位，从标准曲线查出释放的酚量（ug），以此计算处各管的酶活性（v）。2.以1/v为纵坐标、1/s为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值。Y=0.0581x+0.0242,Km=2.401实验二:抑制剂对酶促反映的影响2.另取试

3、管9支，做酶促反应：并计算各管酶活性。以酶活性单位（v）的倒数1/v为纵坐标，以底物浓度s的倒数1/s为横坐标，在方格纸上描点，并连接各点，求该酶的Km值并与前面未加入抑制剂时测出的Km值作比较。Y=0.0832x+0.024,Km=3.47实验分析：通过绘图及分别计算无抑制剂与有抑制剂时酶的Km值，可发现，此抑制剂为竞争性抑制剂。通过绘图发现，其两条以1/v为纵坐标、1/s为横坐标的直线截距几乎相同，而加入抑制剂后，酶的Km值更大，此为竞争性抑制剂的特征：Vmax不变，Km变大。思考题一、除了双倒数作图外，你能举出其它能将酶动力学数据做出直线图的方法吗？1.海涅斯-沃尔弗作图法（hanes-

4、wolffplot）双倒数方程式两边同时乘以s直线的斜率等于1/Vmax，横轴截距为-Km2.伊迪-霍夫斯蒂作图法（eadie-hofsteeplot）米氏方程式两边均除以s直线的斜率为-Km，直线的纵轴截距为Vmax篇二：碱性磷酸酶Km值得测定与分子筛层析碱性磷酸酶Km值得测定【实验（:碱性磷酸酶km值测定实验报告）目的】1.了解磷酸酶Km值的测定原理和方法；2.掌握磷酸酶活性测定的原理和方法；【实验原理】1.在温度、ph及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随底物浓度s增大而增加，但底物浓度增大到一定极限时，则反应速度趋于恒定，即最大反应速度（Vmax）。反应速度与底物浓度之间的关系可用米

5、氏方程来表示，即：Vmax?sV?Km?s2.本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其底物，生成酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌的额衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。其反应如下：磷酸苯二钠?h2o?苯酚?na2hpo4苯酚?4-氨基安替比林?醌类衍生物（红色）【实验器材与试剂】器材：试管架，试管，移液管，移液枪，恒温水浴箱，721型分光光度计试剂：0.02mol/L底物液，ph=10碳酸缓冲液，蒸馏水，酶液，碱性溶液，4-氨基安替比林，铁氰化钾K3Fe（cn）6,oh?AKp,oh?【实验步骤】试剂1234567空白0.02mol/L0.050.

6、100.200.400.600.801.000.00底物液ph=100.900.900.900.900.900.900.900.90碳酸缓冲液蒸馏水0.950.900.800.600.400.200.001.00混合水浴37，预温5分钟酶液0.10.10.10.10.10.10.10.1（0.5mg/ml）加入酶液后立即混匀，37水浴保温，反应开始。并开始计时，反应时间为15min碱性溶液1.01.01.01.01.01.01.01.04-氨基安1.01.01.01.01.01.01.01.0替比林铁氰化钾2.02.02.02.02.02.02.02.0混匀，室温放置10min左右，以空白管调

7、零，测定各管的吸光度（A510）时间步骤现象分析15:50配好底物混合液无明显现象并开始预热55预热结束并加入酶液无明显现象水浴15min16:07水浴结束，依次加入1-5号管红黄生成酚类碱性溶液等试剂，混颜色依次加深衍生物，匀，置于室温下10min6,7管颜色不深6,7号管反应未完全16:17测定各管吸光度【实验结果记录与处理】试管编号12345678A5100.0300.0530.0970.1580.2320.1190.1280.0数据处理试管编号12345678底物浓度0.51.02.04.06.08.0100mmol/L1/s210.50.250.1670.1250.1001/A510

8、33.3318.8710.316.334.318.407.810以1/s为横轴，1/A510为纵轴作图：【计算】根据y=15.071x+3.3668，当y=0时，x=-0.2234，继而Km=2.61mmol/L【实践与思考】1.底物浓度变化对酶促反应速度可造成什么样的影响？在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系，随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降。如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，此时，无论底物浓度增加多大，反应速度也不再增加，说明酶已被底物所饱和。所有的酶都有饱和现象，只是达到饱和时所需底物浓度各不相同而已。2.Km

9、值在酶动力学研究中有什么意义？不同的酶Km值不同,同一种酶与不同底物反应Km值也不同,Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大,表明亲和力小；Km值小,表明亲合力大.【注意事项】1.计算出来的Km值与查资料所得到的值有一定的差距。实验是粗测，本身存在实验误差，我们在操作过程中也造成误差，所以导致与实际值差距较大。2.各管温度的时间一致。分子筛层析（凝胶过滤法）【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理；2.学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。1.凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体，它们的内部有很细微的多孔网状结构。2.在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出

10、柱外，而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以至最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。3.本实验采用葡聚糖凝胶g-25，以水为洗脱溶剂，层析分离大分子蓝葡聚糖（m200万）和小分子黄色重铬酸钾（m=294）。【实验仪器与试剂】仪器：层析柱，试管架，铁架台，试管，小烧杯，胶头滴管试剂：葡聚糖凝胶，蓝色葡聚糖，黄色重铬酸钾，蒸馏水篇三：实验名称碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期20XX年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶（AKp或ALp）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能

11、水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。AKp具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。AKp最适范围为.，动物中AKp主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKp主要来自肝，小部分来自骨骼。AKp可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。一实验原理1、碱性磷酸酶的分离纯化AKp分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离

12、纯化。有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKp。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKp的滤液，AKp能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKp。2、碱性磷酸酶的比活性测定根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（u/mg?pr）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，

13、生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响在环境的温度、和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。酶促反应的速度（）随底物浓度（）的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度就会达到一个极限值，即最大反引发速度（Vmax）。

14、底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表示：式中：Vmax为最大反应速度；s为底物浓度；Km为米氏常数；V代表反应的起始速度。当=Vmax/2时，Km=s。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km值是研究酶动力学的一种重要的方法，大多数酶的Km值在0.01-100mmol/L。Km和Vmax的测定：主要采用Lineweaver-burk双倒数作图法。此式为直线方程，以不同的底物浓度1/s为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/Km，由此可以正确球的该酶的Km值。方程式与图如下：本实验

15、以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度时的酶活性，再根据Lineweaver-burk法作图计算其Km值。实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光值得大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上差得酚的含量，进而算出酶活性的大小。二、实验材料（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定、样品兔肝、试剂0.5mol/L乙酸镁溶液0.1mol/L乙酸钠溶液0.01mol/L乙酸镁0.01mol/L乙酸钠溶液0.01mol/LTris0.01mol/L乙酸镁ph.缓冲液丙酮（分析

16、纯）95%乙醇（分析纯）正丁醇（分析纯）0.04mol/L底物液mg/ml分标准液0.5mol/L?0.3%4氨基安替比林?0.5%铁氰化钾0.1mg/mL蛋白标准液?碱性铜试剂酚试剂、仪器与器材研钵刻度离心管刻度吸管电动离心机玻璃漏斗和玻璃棒托盘天平恒温水浴可见分光光度计（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响、样品兔肝匀浆液、试剂0.04mol/L底物液0.1mol/L碳酸盐缓冲液ph10（37）碱性溶液0.5%铁氰化钾0.3%4氨基安替比林酚标准液（0.1mg/ml）、仪器与器材恒温水浴锅可见光分光光度计三、实验步骤（一）AKp的提取AKp提取实验步骤（二）AKp的比活性测定1、AKp的活性测定AKp活性测定实验步骤2、蛋白质含量测定蛋白质含量测定实验步骤（三）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响1、底物浓度对酶促反应速度的影响将新鲜兔肝用ph10.00.1mol/L碳酸缓冲液匀浆，按20倍稀释即可酶曲线绘制步骤2、酚标准曲线的绘制的绘制酚标准曲线的绘制的绘制步骤