实用HPLC方法的建立.ppt

1、常用HPLC方法的建立目录目录n n1 1 前言前言n n2 2 HPLCHPLC方法建立的步骤方法建立的步骤n n2.1 2.1 了解样品的有关情况了解样品的有关情况n n2.2 2.2 明确分析目的明确分析目的n n2.3 2.3 样品的预处理与检测样品的预处理与检测n n2.4 2.4 HPLCHPLC分析模式的选择分析模式的选择n n2.5 2.5 色谱条件色谱条件n n2.6 2.6 方法的优化，及色谱现象的解析和处理方法的优化，及色谱现象的解析和处理n n2.7 2.7 定性和定量方法的建立及论证定性和定量方法的建立及论证n n3 3 色谱条件的选择色谱条件的选择n n3.1 3.

2、1 流动相的选择流动相的选择n n3.2 3.2 检测器的选择检测器的选择n n3.3 3.3 样品的溶解及预处理样品的溶解及预处理n n3.4 3.4 样品的进样量样品的进样量n n3.53.5色谱柱的选择及保护与再生色谱柱的选择及保护与再生n n3.6 3.6 泵的选择泵的选择n n3.7 3.7 色谱工作站色谱工作站n n4 4 分析方法建立的实例分析方法建立的实例n n4.1 4.1 等度分析等度分析n n4.2 4.2 梯度方法的建立梯度方法的建立n n4.3 4.3 色谱柱及色谱柱及pHpH的影响的影响5 5 色谱分析中各种图谱现象的判断和处理色谱分析中各种图谱现象的判断和处理5.

3、1 5.1 基线噪音的产生和处理基线噪音的产生和处理5.2 5.2 基线漂移基线漂移(上漂和下漂上漂和下漂)5.3 5.3 倒峰的产生和消除倒峰的产生和消除5.4 5.4 鬼峰的产生和消除鬼峰的产生和消除5.5 5.5 峰前移和退后的判断峰前移和退后的判断5.6 5.6 前沿峰和拖尾峰的判断前沿峰和拖尾峰的判断5.75.7色谱双峰的判断色谱双峰的判断5.8 5.8 色谱峰变胖的判断和处理色谱峰变胖的判断和处理1 1 1 1 前言前言前言前言n nHPLCHPLC作为色谱的一个重要分支，在色谱分析中占有重要的作为色谱的一个重要分支，在色谱分析中占有重要的地位，将逐步取代气相色谱成为最重要的色谱分

4、析手段。地位，将逐步取代气相色谱成为最重要的色谱分析手段。随着随着HPLCHPLC技术的发展和科技的进步，使得技术的发展和科技的进步，使得HPLCHPLC广泛应用到广泛应用到各个领域。各个领域。n nHPLCHPLC实验技术是一个实验性很强的操作技能，现行的各类实验技术是一个实验性很强的操作技能，现行的各类书籍并不能包罗一切知识，实践经验非常重要；书籍并不能包罗一切知识，实践经验非常重要；HPLCHPLC技能技能是一个综合性的技能，需日积月累，厚积薄发，非一日之是一个综合性的技能，需日积月累，厚积薄发，非一日之功。功。2 2 2 2 HPLCHPLCHPLCHPLC方法建立的步骤方法建立的步骤

5、方法建立的步骤方法建立的步骤2.1 2.1 了解样品的有关情况了解样品的有关情况n n首首先先应应对对样样品品有有足足够够的的了了解解，并并明明确确分分析析目目的的（同同一样品，不同的测试要求，其方法也可能不一致）。一样品，不同的测试要求，其方法也可能不一致）。n n样品的重要性质包括：样品的重要性质包括：所含化合物的数目；所含化合物的数目；化学结构（官能团）；化学结构（官能团）；分子量；分子量；UV UV光谱图；光谱图；被测组分在样品中的浓度范围；被测组分在样品中的浓度范围；样品的溶解度、沸点及其稳定性；样品的溶解度、沸点及其稳定性；可能存在的干扰物质及样品的复杂程度等。可能存在的干扰物质及

6、样品的复杂程度等。n n1 1 1 1 分析大分子、小分子还是生物分子分析大分子、小分子还是生物分子分析大分子、小分子还是生物分子分析大分子、小分子还是生物分子 一般常规的一般常规的HPLCHPLC分析分子量分析分子量20002000以下，大分子一般采以下，大分子一般采用凝胶色谱用凝胶色谱(包括凝胶过滤包括凝胶过滤、离子交换离子交换、亲和层析亲和层析、疏疏水层析）水层析）、生物大分子采用不能变性的色谱体系。生物大分子采用不能变性的色谱体系。n n2 2 2 2 样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质。样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质。样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质。样品是混

7、合物、天然物质还是基本是单一物质。如果是天然物质，一般分离完全采用梯度体系。混合如果是天然物质，一般分离完全采用梯度体系。混合物中是否有结构类似的异构体，组分复杂的还是采用梯物中是否有结构类似的异构体，组分复杂的还是采用梯度，是否是系列反应的产物。度，是否是系列反应的产物。n n3 3 3 3 测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。主含量的测定一般比较容易；但少量要考虑分离完全主含量的测定一般比较容易；但少量要考虑分离完全的问题；痕量成分则要考虑检测器的类型，采用何种提的问题；痕量

8、成分则要考虑检测器的类型，采用何种提取方法和检测的灵敏度等。取方法和检测的灵敏度等。n n4 4 4 4 分离化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性分离化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性分离化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性分离化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性化合物。化合物。化合物。化合物。n n非极性化合物以正相体系较多，如果溶于反相体系的溶剂，可非极性化合物以正相体系较多，如果溶于反相体系的溶剂，可采用反相体系。采用反相体系。n n弱极性、极性化合物采用反相较为方便，可在流动相中添加改弱极性、极性化合物采用反相较为方便，可在流动相中添加

9、改性剂，调节合适的性剂，调节合适的pHpH。n n离子化合物可以采用离子交换，也可添加离子对试剂离子化合物可以采用离子交换，也可添加离子对试剂；或者采或者采用反相调节用反相调节pHpH 。n n两性化合物中水溶性差的可采用反相；但在反相出峰快的则考两性化合物中水溶性差的可采用反相；但在反相出峰快的则考虑离子交换；也可考虑衍生后测定。虑离子交换；也可考虑衍生后测定。n n对于极性的糖类物质，可用对于极性的糖类物质，可用NH2NH2柱，有条件的用聚合物的糖柱。柱，有条件的用聚合物的糖柱。多糖类的则要采用凝胶系统。多糖类的则要采用凝胶系统。n n大分子的极性化合物、离子化合物，往往采用特定的色谱柱，

10、大分子的极性化合物、离子化合物，往往采用特定的色谱柱，多为聚合物柱子。多为聚合物柱子。n n手性化合物，则要用手性流动相或者采用手性柱。手性化合物，则要用手性流动相或者采用手性柱。n n5 5 5 5 样品的溶解度、沸点样品的溶解度、沸点样品的溶解度、沸点样品的溶解度、沸点n n样品在不同溶剂中的溶解度，对色谱条件的选择非常重样品在不同溶剂中的溶解度，对色谱条件的选择非常重要，测定其溶解的性能，则可以判断其化合物可能的类要，测定其溶解的性能，则可以判断其化合物可能的类型型。n n非极性样品不溶于水，但溶于有机溶剂。如果只能溶于非极性样品不溶于水，但溶于有机溶剂。如果只能溶于非极性溶剂，一般建议

11、做正相。溶于极性溶剂，以反相非极性溶剂，一般建议做正相。溶于极性溶剂，以反相为上策。极性化合物在水和极性溶剂中一般都有一定的为上策。极性化合物在水和极性溶剂中一般都有一定的溶解度。溶解度。n n极性和离子化合物一般都溶于水，但在不同极性和离子化合物一般都溶于水，但在不同pHpH下区别可下区别可能很大。能很大。n n从溶解度可以判断出采用何种体系为佳。从溶解度可以判断出采用何种体系为佳。n n易挥发性的低沸点的物质在易挥发性的低沸点的物质在ELSDELSD中难以检测。中难以检测。n n6 6 6 6 样品的稳定性样品的稳定性样品的稳定性样品的稳定性n n如果样品存在水解、光解、醇解、氧化、分解则

12、测定如果样品存在水解、光解、醇解、氧化、分解则测定时需注意。时需注意。n n对光敏感物质，用棕色瓶避光保存，不宜存放过久，对光敏感物质，用棕色瓶避光保存，不宜存放过久，随配随做。随配随做。n n易水解的物质，、要选择合适的溶解溶剂。易水解的物质，、要选择合适的溶解溶剂。n n有些样品可能存在醇解，流动相不能用甲醇，而要用有些样品可能存在醇解，流动相不能用甲醇，而要用乙腈。乙腈。n n易氧化的物质，溶解时可考虑加抗氧剂，调节易氧化的物质，溶解时可考虑加抗氧剂，调节pHpH，如如PAPPAP（对氨基苯丙酮）的测定。胺类化合物。对氨基苯丙酮）的测定。胺类化合物。n n产品不稳定的化合物，分析越快越好

13、。产品不稳定的化合物，分析越快越好。n n7 7 7 7 化合物的化学结构化合物的化学结构化合物的化学结构化合物的化学结构（官能团）（官能团）n n常见的基本结构是苯环、杂环、多环芳烃。基团有常见的基本结构是苯环、杂环、多环芳烃。基团有COOHCOOH、OHOH、NH2NH2、SO3HSO3H、ClCl（BrBr）、）、CHOCHO、COCO、CH3CH3、C2H5C2H5、N=NHN=NH、SOSO、SO2SO2、-O-O-等。等。n n亲水性的基团在反相中出峰时间前移，疏水性的基团亲水性的基团在反相中出峰时间前移，疏水性的基团出峰后移。出峰后移。n n从存在的结构可以判断出其在溶剂中的溶解

14、度。从存在的结构可以判断出其在溶剂中的溶解度。n n8 8 化合物的化合物的pK pK 值值n n知道知道pKpK值，有助于方法的建立，尤其流动相值，有助于方法的建立，尤其流动相pHpH的选择。的选择。n npKpK的差异是官能团造成的。的差异是官能团造成的。n n9 UV9 UV光谱图光谱图n n知道其吸收波长的曲线有助于检测，如果有知道其吸收波长的曲线有助于检测，如果有DADDAD则则关系不大。多组分的样品，宜多选几个波长。关系不大。多组分的样品，宜多选几个波长。n n同一样品在不同的流动相及同一样品在不同的流动相及pHpH最大波长可能不一最大波长可能不一致。致。n n有双键共轭的结构紫外

15、吸收较大，单键的则在低有双键共轭的结构紫外吸收较大，单键的则在低紫外区有一定的吸收紫外区有一定的吸收n n10 10 样品的复杂层度样品的复杂层度n n梯度方法分析梯度方法分析n n预处理预处理,分成几个部分分析分成几个部分分析n n痕量物质的富集痕量物质的富集n n总之，充分了解了被分离样品的性质，将可能提总之，充分了解了被分离样品的性质，将可能提供一个参考的分析条件，缩短分析时间和分析难供一个参考的分析条件，缩短分析时间和分析难度。度。2.2 2.2 明确分析目的明确分析目的n n1 1 定量分析？检出某种物质？未知物的确定？纯化制备定量分析？检出某种物质？未知物的确定？纯化制备？光谱鉴定

16、？光谱鉴定？n n2 2 是否将所有组分分开，定性？一种条件有困难？分组是否将所有组分分开，定性？一种条件有困难？分组分析？分析？n n3 3 定量分析的准确度和精密度？（主成分在定量分析的准确度和精密度？（主成分在1 12 2）n n4 4 不同样品基质对分离的影响（如原料药、粗品、精品、不同样品基质对分离的影响（如原料药、粗品、精品、残留、环境样品等）残留、环境样品等）n n5 5 分析的工作量，少数还是大量？时间和效率与分离的分析的工作量，少数还是大量？时间和效率与分离的选择。选择。n n6 6 实验室的条件，如实验室的条件，如HPLCHPLC仪器的配置和档次；色谱柱系仪器的配置和档次；色谱柱系统；是否有恒温；是否可以做梯度；分析成本；实验室统；是否有恒温；是否可以做梯度；分析成本；实验室人员的操作技能；方法的移植等等。人员的操作技能；方法的移植等等。2.3 2.3 样品的预处理与检测样品的预处理与检测n n样品来源的形式样品来源的形式n n1 1 可直接进样的溶液（注意是否与流动相匹配）可直接进样的溶液（注意是否与流动相匹配）n n2 2 需稀释、需稀释、pHpH缓冲、加内标或