青蒿素生物合成分子机制及调控研究进展Word文档格式.docx

1、青蒿素来源于菊科蒿属药用植物黄花蒿Artemisia annua L，其干燥地上部分被称为中药青蒿67。黄花蒿是青蒿素的唯一天然来源，但是其含量却相对较低，只占干重的01%08%89。如何提高青蒿素产量，降低生产成本，是当前國内外黄花蒿育种研究的热点。已有许多科学家正在尝试用不同的方法来增加青蒿素的产量，合成生物学及化学合成在青蒿素生物半合成上取得了较大进展10。由于酵母无法像黄花蒿腺毛一样提供青蒿素合成所需的特殊油性氧化环境，所以目前还无法实现青蒿素的体外生物全合成，因此目前青蒿素的市场供应仍然依赖于植物提取10。未来青蒿素的市场可能是植物来源和生物半合成的协调平衡11。为了提高青蒿素产量，

2、在青蒿素生物合成途径代谢酶的调控方面已有较多研究。在黄花蒿中过表达青蒿素生物合成的关键酶基因或抑制与青蒿素生物合成竞争相同底物的酶基因的表达，通过转录因子或植物激素来直接或间接地提高青蒿素的含量1213。这些方法都在一定程度上提高了黄花蒿中青蒿素的含量12，如果要进一步提高青蒿素的产量，还需开发新的方法。前期研究表明，青蒿素在黄花蒿地上部分表面的一种突起结构腺毛中合成、积累和分泌1415。作为青蒿素生物合成的“化学工厂”，调控腺毛发育有可能实现青蒿素含量大幅提高。1青蒿素合成于黄花蒿腺毛腺毛是毛状体（trichome）的一种，毛状体是许多植物叶片和其他器官表面的小突起结构，它们的最大特征就是能

3、够合成，储存，有时候还能分泌大量特定的代谢产物16，包含多种类型的萜烯，苯丙烷衍生物，酰基糖，甲基酮和类黄酮。许多毛状体产生的化合物具有重要的医药，香料，食品添加剂，天然杀虫剂等商业价值。近年来将腺毛开发成“化学工厂”来生产高价值的植物产物引起了植物生物技术专家的关注17。腺毛通过表皮细胞分化而形成，以各种各样的形态结构存在于不同植物表面18。腺毛形态的多样性不仅因物种不同而异，同一物种、同一株植物中腺毛的形态也会表现出多样性。通常来说，腺毛可以根据形态和功能被分为分泌型腺毛和非分泌型腺毛两大类。分泌型腺毛具有多个细胞，能合成、分泌和贮存多种植物次生代谢产物，并广泛分布在唇形科植物如薄荷19，

4、茄科植物如番茄20，菊科植物如黄花蒿18和大麻科植物如大麻21中。非分泌型腺毛基本为单细胞，主要作为物理防御器官。有些也能合成次生代谢产物，如三萜类物质22。非分泌型腺毛广泛分布在锦葵科植物如棉花23和十字花科植物如拟南芥24中。腺毛是植物对抗外界胁迫的第一道屏障，可以保护植物本身免受外界昆虫、细菌、紫外辐射以及干旱等的影响25。特别是分泌型腺毛，可以通过释放一些对昆虫和动物有害的化学物质（通常为一些次生代谢产物），从而阻挡它们对植物体的进一步侵害。此外，青蒿素和一些其他生物活性物质对植物本身有很高的毒性26，所以将其扣留在或者分泌出合成部位就显得非常重要。腺毛的表皮下空间很可能就是黄花蒿扣留

5、青蒿素和其他植物毒性物质的场所14。与自然界中腺毛的分类相同，黄花蒿中腺毛也可以分为2类，即分泌型腺毛（AaGSTs）（图1绿色箭头）和非分泌型腺毛（又称T型腺毛，AaTNGs）（图1蓝色箭头）。它们都起源于表皮细胞14，27。其中AaGSTs 由2列5对、10个细胞组成，包含2个基细胞（basal cells，Ba），2个柄细胞（stalk cells，St），4个下顶细胞（subapical cells，Suc）和2个顶细胞（apical cells，Ac），以及1个皮下腔空间（subcuticular space，SS）（图1）。2个顶细胞和4个下顶细胞又称为分泌细胞14。AaTNGs

6、由5个纤维状细胞组成，头部还有1个特别细长的细胞，最终形成一个类似于英文字母大写“T”的结构28。叶细胞分化成腺毛细胞起始于最早的叶原基时期，当10个细胞形成后，6个分泌细胞的角质层从细胞壁分离形成1个2列的囊腔，并最终裂开释放内含物14。在整个发育时期，腺毛细胞都含有很少的液泡，分泌细胞含有较多的内质网，每一对细胞的质体都是不一样的14。在成熟期，顶细胞含有前质体和白色体，只有少量的类囊体。而下顶细胞含有大量的叶绿体，不具有淀粉粒。基细胞有前质体或者白色体，柄细胞有叶绿体14。Duke等通过5 s的氯仿浸泡，可以提取黄花蒿叶片中97%的青蒿素和全部的青蒿烯，同时发现除了分泌型腺毛的皮下腔空间

7、（SS）塌陷了，叶片表面并没有其他破坏，因此认为青蒿素和青蒿烯全部储存在分泌型腺毛的皮下腔空间15。而且青蒿素只存在于含有腺毛的种中15，因此腺毛也被认为是青蒿素体内合成、分泌、积累及储存的场所，但是青蒿素如何在腺毛内合成不清楚。由于下顶细胞与顶细胞的结构及内含物不同，关于青蒿素是只在顶细胞中合成，还是在6个分泌细胞中都合成一直存在较大争议。Olsson等17因在4个下顶细胞中没有检测到青蒿素生物合成关键基因ADS，CYP71AV1和DBR2的表达，认为下顶细胞不能合成青蒿素，可能具有与顶细胞不同的功能，比如合成单萜类化合物。2012年Olofsson等29通过激光显微切割和qRTPCR提出顶

8、细胞和下顶细胞都能合成青蒿素。腺毛转录组数据分析显示下顶细胞中存在所有青蒿素生物合成途径基因的表达22。因此，青蒿素是否由分泌型腺毛的下顶细胞和顶细胞共同产生，还需要细胞化学的研究证据来进一步确证。此外，黄花蒿腺毛转录组数据分析还发现非分泌型腺毛中也存在倍半萜和三萜类生物合成特异性基因的表达，这暗示非分泌型腺毛T型腺毛，也可能具有与分泌型腺毛相似的功能。2青蒿素生物合成途径青蒿素的生物合成途径属于类异戊二烯代谢合成途径，起源于异戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）。高等植物中

9、，这种5C骨架的化合物有2条独立的生物合成途径，分别为位于胞质的甲羟戊酸（mevalonate，MVA）途径和位于质体的甲基赤藓醇4磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途径（图2）。文献报道已经确定MVA途径和MEP途径对最后生成青蒿素的贡献度是不同的30。法呢基焦磷酸（famesyi diphosphate，FPP）的形成是青蒿素生物合成的第一个特异性步骤，2010年Schramek等30通过13CO2 同位素标记证明，FPP由2份来源于MVA途径的异戊二烯和1份来源于MEP途径的异戊二烯形成（图2 不同粗细的线条示不同贡献），因此MVA途径在青蒿素生物合成中

10、起主要作用。以FPP為分界线，FPP之前的步骤被认为是青蒿素生物合成的上游步骤，FPP之后的步骤被认为是青蒿素生物合成的下游步骤。青蒿素上游合成途径已经比较清楚，且有公认的酶及催化步骤3132，但下游步骤仍存有争议。青蒿素生物合成的上游及下游路径由图2所示，黑色字体为青蒿素合成代谢路径中的化合物，蓝色字体所示为参与这一过程的基因。青蒿素由MVA途径和MEP途径提供IPP，经催化后形成FPP。FPP经紫穗槐二烯合成酶（amorpha4，11diene synthase，ADS）催化生成紫穗槐二烯33。紫穗槐二烯经过三步由细胞色素P450单氧化酶（cytochrome P450 monooxyge

11、nase，CYP71AV1）催化的反应，分别形成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸3436。其中青蒿醇可以被催化形成二氢青蒿醇37。青蒿醛可以被青蒿醛双键还原酶artemisinic aldehyde delta11（13） reductase，DBR2催化形成二氢青蒿醛37。二氢青蒿醛可以被醛脱氢酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）38催化形成青蒿酸的直接前体二氢青蒿酸，也可以被二氢青蒿醛还原酶（dihydroartemisinic aldehyde reductase，RED1）催化形成上一步的产物二氢青蒿醇39。二氢青蒿醇可以被CYP71AV1和ALDH1催化形成二氢

12、青蒿醛，最后经二氢青蒿酸形成青蒿素。青蒿素合成下游途径还存在一些争议，AlejosGonzalez 等402011年提出青蒿酸可转化为青蒿素B和青蒿烯，进而形成青蒿素。但是通过青蒿酸和二氢青蒿酸前体饲喂实验证明二氢青蒿酸才是青蒿素的直接前体37，青蒿素B和青蒿素可能是青蒿素生物合成途径上的2个不同分支的终产物34。在释喂实验中没有提及青蒿烯，可能由于青蒿素B和青蒿烯不稳定，不易检测到。因此青蒿酸是否能通过青蒿烯进而转化成青蒿素还未知。此外，二氢青蒿酸与青蒿素之间是否真的仅需要腺毛提供的特殊油性环境加上光照条件就能顺利转化，是否存在未知的氧化步骤和酶也是未知的。青蒿素下游合成途径在青蒿素生物合成

13、中具有十分重要的作用，正确解析青蒿素生物合成下游途径对于有效开展代谢工程，进而提高青蒿素含量意义重大。腺毛包含了青蒿素生物合成所需要的全部因素，对腺毛进行调控可以避开青蒿素生物合成途径上存在的暗箱，从宏观上调控青蒿素的生物合成。3青蒿素含量的代谢调控目前针对于青蒿素的代谢调控研究策略主要分为3大类。一是过表达青蒿素合成路径中的关键酶基因或阻断青蒿素合成竞争性支路上的关键酶基因；二是通过转录因子调控青蒿素生物合成途径；三是通过植物激素等间接调控青蒿素的合成。31生物合成途径关键酶基因调控311通过单基因的过表达已经进行单基因过表达的青蒿素生物合成途经基因有HMGR，FPS，DXR，DBR2，AL

14、DH1，ADS，这些基因在青蒿素的生物合成途径上的位置显示（图2）。HMGR是3羟基3甲基戊二酰辅酶A合成酶，能够将HMGCoA分流到IPP途径来，从而促进青蒿素的合成。Aquil等4142在2009年将长春花中的HMGR基因过表达在青蒿中后，能将青蒿素的产量提高225%389%。此外，HMGR也能促进青蒿酸的合成，酵母表达体系中，3个拷贝的HMGR基因比单拷贝的更能提高青蒿酸的产量10，43。FPS是法呢基焦磷酸合成酶，能够将牻牛儿基二磷酸（GPP）转化成法呢基焦磷酸（FPP）。FPP是一个重要的分支点，也被认为是青蒿素合成下游途径的起点。过表达木本棉FPS 基因可以提高青蒿素产量到23倍4

15、4。过表达黄花蒿内源FPS 基因也能将青蒿素含量提高到225倍。但是转入2个拷贝的FPS 基因反而会降低转基因材料中青蒿素的产量4546。DXR基因是1脱氧D木酮糖5磷酸还原异构酶47，是质体中合成IPP的MEP途径第二步（图2），DXR基因过表达能将青蒿素的产量提高到121235倍48。此外，膦胺霉素能够阻断DXR催化的这一步反应，即阻断DXP转化成MEP49，100 molL-1的膦胺霉素处理14 d，能将青蒿素的产量降低25%50。ADS是紫穗槐4，11二烯合成酶，能够催化青蒿素合成下游途径的起始步骤（图2），将FPP转化成紫穗槐4，11二烯5152。而且通过对启动子的研究发现ADS基因

16、特异地表达在腺毛中5354，而腺毛是青蒿素产生和储存的地方，因此ADS基因是调控青蒿素合成的重要靶标。将青蒿酸喷涂到黄花蒿上可使ADS基因的表达降低10倍，说明在青蒿素的合成、积累中存在负反馈抑制55。ADS基因的过表达，可将青蒿素、青蒿酸、二氢青蒿酸的含量分别提高82%，65%和59%56，但是ADS的直接产物紫穗槐4，11二烯并没有明显增多，应该是快速被下游反应消耗了51。DBR2是青蒿醛11（13）还原酶，能够将青蒿醛还原成二氢青蒿醛，在DBR2过表达的转基因植株中，青蒿素的含量显著提高，最高达到非转化对照植株的283倍57。ALDH1是乙醛脱氢酶，能够催化青蒿醛转化成青蒿酸。黄花蒿内源

17、的ALDH1基因过表达可将青蒿素含量最高提高到干重的256 mgg-1，是非转化对照（8 mgg-1干重）的32倍58。312通过多基因的过表达将代谢途径中多基因过表达可以同时打破多个瓶颈步骤，往往比单个基因的过表达更能提高青蒿素含量。已经进行组合的青蒿素生物合成途径基因为CYP71AV1/CPR，HMGR/ADS，HMGR/FPS，ADS/CYP71AV1/CPR和FPS/CYP71AV1/CPR。CYP71AV1是细胞色素P450单加氧酶，是一种多功能的倍半萜氧化酶在青蒿素的合成中起关键作用，它能通过3步将紫穗槐4，11二烯转化成青蒿醇、青蒿醛并最终生成青蒿酸36。CPR是细胞色素P450

18、氧化还原酶，它可以和CYP71AV1一起作用，帮助CYP71AV1将紫穗槐4，11二烯转化成更氧化的产物43。CYP71AV1也特异地表达在分泌型腺毛中35，并且涂抹青蒿素或青蒿酸时会大大降低CYP71AV1的表达55。内源CYP71AV1和CPR基因在黄花蒿中共同过表达时可以提高青蒿素产量38%48，59。FPS，CYP71AV1和CPR 3个基因分别通过CaMV35启动子驱动，同时过表达能将青蒿素的产量提高到36倍60。ADS，CYP71AV1和CPR 3个基因同时过表达可提高青蒿素量到151 mgg-1干重，是对照的24倍61。将长春花来源的HMGR基因和黄花蒿来源ADS同时过表达可大大

19、提高青蒿素的产量，最高的转基因植株可达到173 mgg-1干重，比对照提高765倍62。将HMGR基因和FPS基因同时过表达后，同样可以将青蒿素的量提高到9 mgg-1干重，是对照的18倍63，但是HMGR和FPS同时过表达并没有比HMGR或FPS单基因过表达更明显地提高青蒿素含量63。313通过阻断青蒿素合成竞争性支路上的关键酶基因来提高青蒿素的含量法尼基焦磷酸（FPP）是青蒿素合成下游路径的起始步骤，同时FPP也能被其它倍半萜合成酶催化生成不同的倍半萜，从而和青蒿素合成途径竞争FPP底物。甾醇合酶SQS催化甾醇生物合成途径的第一步，是青蒿素合成的竞争性支路64。当SQS基因的表达通过RNA

20、i抑制时，青蒿素的量可大大提高到314 mgg-1干重，是非转基因植株的314倍65，但是4种主要甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇和麦角甾醇的含量都降低了，虽然甾醇的降低并没有明显影响青蒿的生长及植株的总生物量65。石竹烯合成酶（CPS）能够将FPP转化成石竹烯，也是青蒿素合成的竞争性支路66。CPS基因的表达被抑制后，石竹烯的含量降低了40%60%，而青蒿素的含量提高了549%67。因此抑制竞争性支路来提高青蒿素含量也是一种可行的提高青蒿素含量的办法。32转录因子调控转录因子是通过转录水平或转录后水平上调控目的基因的表达来调控植物生长发育及生理代谢的。转录因子通过与被调控基因启动子上顺式作用元

21、件结合，激活一个级联或整个网络的基因，这种特征使其成为代谢工程的强大工具，对药用植物的育种改良有重要价值。利用不同家族的转录因子，可以实现对多个化合物合成途径的调控，这在植物和动物的研究中已经得到了充分的证实。目前已经报道的能调控青蒿素合成的转录因子主要集中在WRKY，AP2/ERF，bZIP，bHLH 4大家族。AaWRKY1特异地表达在腺毛中，并能被茉莉酸甲酯诱导，是第一个报道的能调控青蒿素合成的转录因子。AaWRKY1通过结合青蒿素合成途径上ADS和CYP71AV1基因启动子上的Wbox来激活ADS和CYP71AV1基因的表达。AaWRKY1的过表达可将青蒿素的量提高到19 mgg-1干

22、重，是对照的19倍6869。AP2/ERF是一类在初生、次生代谢，植物的生长发育，应对环境刺激方面都有重要作用的家族71。目前已经报道的能调控青蒿素合成的该家族成员有AaORA7273，AaERF1，AaERF274和AaTAR1754个。AaORA是青蒿素合成的正向调控子，GUS染色证实AaORA特异地表达在分泌型和非分泌型腺毛中，AaORA的过表达可将青蒿素和二氢青蒿酸的含量分别提高40%53%和22%35%7273。AaERF1，AaERF2来源于分泌型腺毛的cDNA文库，属于ERF亚家族成员的B3组（能响应茉莉酸和植物保护的正向调控因子）70，74。通过酵母单杂和EMSA实验证实AaE

23、RF1，AaERF2可以和青蒿素合成路径上的关键酶基因ADS，CYP71AV1启动子上的CBF2，RAA结构域结合，从而来调控青蒿素的合成。AaERF1或者AaERF2的过表达都可显著提高青蒿素和青蒿酸的含量70，74。AaTAR1是另外一个非常重要的調控青蒿素合成的AP2/ERF类转录因子75。TAR1在幼嫩叶片分生组织、幼嫩花苞及分泌型和非分泌型腺毛中表达，在TAR1GFP的转基因黄花蒿植株中，TAR1蛋白特异地定位在幼嫩叶片的细胞核。当TAR1基因通过RNAi抑制后，青蒿素、青蒿酸、二氢青蒿酸的含量大大降低，同时分泌型及非分泌型腺毛的形态出现异常，叶片表面角质和蜡质成分也发生改变，导致叶

24、片的渗透性增强。当TAR1过表达时青蒿素、青蒿酸、二氢青蒿酸的含量升高，并且ADS，CYP71AV1基因的表达上调上千倍。并进一步通过EMSA、酵母单杂和体内转基因实验证实TAR1也能够与ADS，CYP71AV1基因启动子上的CBF2，RAA结构域结合，从而激活这2个基因的表达，来促进青蒿素的合成75。此外AaTAR1除了可以直接调控青蒿素合成路径基因ADS和CYP71AV1外，还可以控制蜡质合成从而影响黄花蒿腺毛的发育75。bZIP家族也是一类非常大且功能多样的转录因子家族，但是其调控植物次生代谢的报道却很少。AabZIP1是从100多个黄花蒿bZIP家族成员中通过基因表达、系统进化分析和双

25、荧光素酶实验筛选出的与ADS和 CYP71AV1有相似表达特征的bZIP家族基因，并进一步证明AabZIP1通过结合ADS和CYP71AV1基因启动子上的ABRE结构域来激活基因的表达，促进青蒿素的合成。AabZIP1基因过表达的植株对脱落酸（ABA）敏感，外源施加ABA能进一步促进青蒿素的积累76。bHLH是最大的转录因子家族之一，参与许多重要的发育和生理过程。近年来越来越多bHLH转录因子成员被报道能参与植物次生代谢的调控，例如拟南芥中花青素71和倍半萜77的合成，长春花中生物碱的合成7879。AabHLH1是从黄花蒿分泌型腺毛cDNA文库中获得的1个bHLH家族转录因子，AabHLH1能

26、够和ADS，CYP71AV1启动子上的Ebox顺式作用元件相结合，激活基因的表达，从而正向调控青蒿素的合成80。AaMYC2是黄花蒿中能够响应茉莉酸诱导的bHLH转录因子，它可以结合到CYP71AV1，DBR2启动子上的Gbox顺式作用元件，从而激活这2个基因的表达。在AaMYC2过表达的转基因植株中，不仅青蒿素的含量增加了，黄花蒿对灰霉菌的抗性也有显著的增强81。33植物激素调控植物激素茉莉酸及其衍生物是一类重要的信号分子，调控植物的次生代谢来增强植物对抗生物及非生物胁迫8283。外源施加茉莉酸甲酯不仅可以提高黄花蒿的次生代谢，提高青蒿素的产量49%84，而且可以增加分泌型腺毛的密度8586

27、。茉莉酸产生于脂氧化物合成途径上的一个特异分枝，其中丙二烯氧化物环化酶（AOC）催化其中的一个重要步骤84。AaAOC基因是从黄花蒿中克隆到的丙二烯氧化物环化酶基因，在AaAOC基因过表达的植株中，茉莉酸的含量可以达到对照的247倍，青蒿素合成代谢途径中多个基因的表达上调，同时分泌型腺毛的密度也增加了，在一些转基因植株中青蒿素的含量也提高了879%12，87。植物激素ABA在植物的生长及对抗环境胁迫，包括干旱、盐、冷及渗透性等逆境中起到重要的作用88。外源ABA喷洒开花前的黄花蒿叶子可提高青蒿素含量89。AaPYL9是黄花蒿中的ABA受体，AaPYL9过表达的转基因植株，相对于野生植株对ABA

28、的敏感性显著增加。在没有ABA诱导时，其青蒿素含量和对照没有差异，但是ABA的诱导可使其青蒿素含量增加74%95%，明显高于野生型的33%，并且蒸腾作用降低，对干旱的耐受性增强90。CRY1是拟南芥光信号通路中的重要受体，其过表达能促进许多物种中次生代谢物的积累91。在黄花蒿中过表达拟南芥CRY1基因不仅能提高青蒿素的含量30%40%，同时也能提高花青素的积累92。目前所做的青蒿素合成调控多是针对青蒿素合成代谢路径的，而已经报道的青蒿素合成相关的基因都在腺毛中高表达或特异性表达。分泌型腺毛是青蒿素的“生物合成器”。因此通过调控腺毛来提高青蒿素的含量有可能也是一种比较有前景的代谢工程手段。4腺毛

29、的生长发育及调控研究腺毛的生理和代谢产物的特殊性以及相关生物合成酶基因在其中的高表达使其成为天然产物生物合成基因组研究的重要对象。例如由腺毛特异表达基因cDNA组成的EST数据库已被用来确定薄荷Menthax piperita中负责萜类化合物的合成酶19；九层塔Ocimum basilicum中苯丙烯类的合成酶94；番茄Solanum lycopersicum中甲基酮的合成酶95；黄花蒿中倍半萜类的合成酶9698；啤酒花Humulus lupulus中烯类99和萜类的合成酶100。作为青蒿素合成、分泌和贮存的器官，黄花蒿分泌型腺毛的研究还非常少，而非分泌型腺毛研究更少。尽管在模式植物拟南芥中报

30、道了相对较多关于腺毛形态、密度和发育的信息，但是在拟南芥中只存在非分泌型腺毛。黄花蒿中存在非分泌型和分泌型腺毛，两者的形态和功能完全不同，影响二者的因素也不完全相同，有研究指出二者由不同网络调控16。因此，拟南芥腺毛的研究成果只有部分的借鉴意义，黄花蒿腺毛的研究还需进一步深入地开展。通过总结腺毛研究较多的拟南芥、番茄、烟草、棉花等物种，可发现影响腺毛的因素归结为3类，即基因，microRNA和植物激素。其中基因起主导作用，microRNA和植物激素都是通过调控腺毛有关基因来影响腺毛的形成和发育。41基因对腺毛的影响目前关于黄花蒿腺毛的研究还非常少，已经报道的与黄花蒿腺毛相关的基因只有TAR1（trichome and artemisinin reg