16SrDNA的提取鉴定Word文档下载推荐.docx

1、必须已知部分序列设计出引物，10-30bp。以此类推，呈几何级增长。一般进行25-35个扩增循环DNA可扩增106109倍。三、实验步骤（一）细菌基因组DNA提取技术路线：具体步骤：1. 挑单菌落接种到10 mL 高氏液体培养基中37，振荡过夜培养。（菌体培养）2. 取2 mL培养液到2 mL Eppendorf管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。3. 再往同一离心管中2 mL培养液到2 mL Eppendorf管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。4. 加入200 L 缓冲液GA，充分悬浮、混匀，将菌体彻底悬浮。5. 再加入20 L Protein K，混匀，55温育10分

2、钟。（55为酶最适温度）6. 加入220 L缓冲液GB，混匀后，55温育10分钟。（实为50-60之间）7. 加入220 L 无水乙醇（降低体系粘稠度），充分混匀。将上清（挑去其中絮状杂质，少部分，会产生气泡，除不去）小心转入UNIQ-10柱（羟基纤维素膜，特异吸附核酸，因为吸附有限，所以损失核酸）中。13000 rpm（离心机最高设定实为10000rpm）离心5分钟，倒弃收集管内的液体。6. 加入500 L GD Solution，10000 rpm离心1分钟。8. 加入500 L 70乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。（离心机最小设定实为1min，仪表盘

3、上显示时间的梯形最小面积为1min，所以没法在到梯形面积中间时按暂停）9. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5 mL的离心管。10. 加入50 L预热（60）的洗脱缓冲液（TE，含RNase），加到柱子中间的膜上。 60放置5分钟。12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为基因组DNA。11. 电泳。取5 L提取DNA溶液+2LLoading Buffer（不用吸放混匀，以免机械损伤DNA）进行电泳检测质量。（吖啶橙做染色液，橙红色）（二）PCR扩增1. 根据已发表的16S rDNA序列设计保守的扩增引物。16S （F） 5-AGAGTTTGATCCTGG

4、CTCAG-316S （R） 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-32. PCR扩增体系：在0.2 mL Eppendorf管中加入1L DNA，再加入以下反应混合液： 16S （F） 1L （10M） 16S （R） 1L （10M） 2PCR Mix 25 L（含10PCR Buffer，dNTP，Taq酶） ddH2O 22 L（最先加）反应体系50 L，简单离心混匀。3. PCR反应将Eppendorf管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。扩增条件为： 94 3 min 94 30 sec 50（实为52）45 sec 35 cycles 72 100 sec（因为Taq酶

5、1Kb/min,时间为经验所得） 72 7 min（充分延伸）4. PCR产物的电泳检测拿出Eppendorf管，取出全部溶液点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶大孔中。电泳1 hr。在紫外灯下检测扩增结果（下午1:50）。（三）扩增片段的回收根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带，并回收目的片段。1）称量一2 mL.的Eppendorf管质量，记录0.99g。2）在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2 mL的Eppendorf管内，称量1,06g。计算凝胶质量0.07g。3）每100 mg凝胶加入300 L Buffer DE-A（促融），混匀。

6、70温育至凝胶融化。4）加入0.5倍体积的Buffer DE-B（帮助连接），混匀。全部转入UNIQ-10柱（?），10000 rpm离心1分钟，倒去收集管（与之前的试剂盒中的收集管规格不同）内的液体。5）加入500 L Buffer W1（Wash Solution），10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。6）加入500 L Buffer W2（去盐液，70%乙醇），10000 rpm离心0.5分钟。（离心机最小设定实为1min）7）再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。8）加入30 L预热的洗脱缓冲液（Eluent），60放置3分钟

7、。12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为回收的DNA片段。（四）DNA片段测序将回收的片段（足量）送至生物公司测序，测序引物为16S PCR引物。（Sanger双脱氧法，一边PCR，一边测序）四、实验结果及分析1细菌基因组提取DNA 电泳结果：第十一泳道为我组结果，条带清晰，说明提取的DNA含量较高。2. PCR产物的电泳检测：正极点样孔为大孔，96L。Marker 6条带，清晰明亮。第五泳道为我组结果，可见条带清晰，说明提取的DNA含量较高。3. 根据测序结果，到NCBI Blast项目上进行比对，确定该未知菌的种属。分析讨论实验的过程及结果。选择序列三：1）打开网站www.ncbi.

8、nlm.nih.gov，选取BLAST。2）选择核酸比对3）将序列粘贴到框中，下面的方框选Reference genomic sequence，按BLAST，得到结果。 序列三与葡萄球菌属细菌的16S rDNA基因相同性最高,与Staphylococcus saprophyticus subspATCC.的16S rDNA基因的相同性为99%。可初步判定序列三所属菌株可能是Staphylococcus属的成员。如果要明确的得到其种属，还要进行相关的生理生化分析。（四）结果处理：生成文件，制作进化树。1）点击Rrna-16S ribosomal RNA进去后，按图示点击，Create Files

9、,保存在文件夹中，供生成进化树时使用。每一种保存一次，我们共对20组生成了文件，保存在一个文档中。2）运行MEGA 5.05软件，按如下操作，打开下载下来的Sequence文件。4）点击Alignment,Align by ClustalW，然后按OK键，等待。 5）得到以下画面，删除序列两端不能对齐的碱基（不同源）。6）按Data,Phylogenetic Analysis,关闭窗口，将文件保存。7）选择一个方法，构建系统发育树。8）Bootstrap 选择1000，点击compute开始计算。9）得到最终的进化树。（我们用的是样品3，命名为Alice）五、分析讨论（一）本次试验主要是通过1

10、6S rDNA的方法来鉴定细菌种属，通过提取基因组DNA、PCR扩增、电泳检测，最后将得到的序列在NCBI上比对，找出与之同源性最大的菌种，最后用MEGA4软件制作出进化树。在做这个时要注意的地方：1细菌基因组DNA的提取中，加入缓冲液GA后要彻底悬浮菌体，来回吸打几次，使菌体彻底悬浮，切记不要产生气泡。2加完GB缓冲液后，手拿Eppendorf管轻轻地上下颠倒混匀，令其充分反应，破坏细胞膜。加完无水乙醇后会看到澄清透亮的液体中有一团白色的残渣漂浮着，用枪头小心地把它挑出，避免抽入不溶性的絮状沉淀，否则后面会出现较多的粘稠状物质堵住膜孔3离心前要精确平衡，避免对离心机造成机械损害4预热的洗脱缓

11、冲液要竖直打到硝酸纤维素膜上，该膜能特异性的吸附核酸，若打到壁上会造成损失5提取好的基因组DNA要在4条件下保存6在制作PCR扩增产物时，先加水，打DNA液时将枪头伸入水中，防止有DNA液损失在壁上。其他的可以几个人一组制成大体系混合液，这样取用更加方便而且准确；7取液时注意试剂瓶上的标志，如10、6等，用前记得稀释；8割胶的时候要带手套，带好紫外线防护罩，防止伤害眼睛。9通过查找资料，我们摸索出了在NCBI上进行序列比对以及构建进化树的方法，过程很艰辛，但结果令人欣慰。10构建进化树时，一定要参考多和同学们讨论，有条件时多多向实验室的研究生学长学姐请教，他们经常会用到BLAST和MEGA软件，知道很多小技巧和注意事项，在做进化树的时候给我很大的帮助。11（二）1由于核糖体进化保守，所以可以通过测定核糖体16S rDNA（序列约1.5KB）来鉴定细菌种属。若要鉴定真核生物，则测定核糖体18S rDNA。2氯仿抽提可以去除蛋白（中间层）和有机物，G+菌用溶菌酶，G-菌用细胞膜裂解液。GA为Tris-Hcl，GB为裂解缓冲液SDS。3好引物的特点：扩增产物多，杂带少。4由于分子生物学实验的特点是实验时间长，中间等待时间长，涉及的高值仪器多，接触有害试剂多，实验原理较复杂，所以我们要严格遵守实验室纪律，认真做好实验，认真做好值日 ，从有限的学时中真正地学到东西。