裸鼠成瘤实验超详细资料Word文档格式.docx

1、因为造模周期短，很可能生长速度也会被加快，肿瘤可能很快就溃烂了，这样就不得不被迫中止实验，而用药却没有用到足够的时间，药效还没有发挥出来就结束了，这样是很不利的。所以一般情况下，应该尽量的复合这个瘤株本身的生长特性，不应该过多地去加以人为的干扰。是否用手术标本荷瘤如果是药效试验，不建议用手术标本，因为SFDA的临床前研究指导原则上明确指出要用建株的肿瘤株进行试验，因为用手术标本的试验可重复性太差，你这个标本万一没有保存好，断掉了，你自己都很难重复出上次的试验结果。国外的文献上看到的却很少有人用手术标本构建模型进行试验。取材的部位：肿瘤生长活跃，状态良好，结缔组织比较少的地方。运送途径：无菌、冰

2、浴保温，无菌培养液浸泡，时间不能超过1个小时。最好一个小时内就能够接种到动物体内。接种部位：腋下。另外，手术标本还有一个风险：你不能保证取得的标本一定能够顺利地成瘤并且用于试验。注意事项A裸鼠的周龄,B肿瘤细胞:何种肿瘤,接种细胞的数量（用对数生长期的,活力高的）记数要准确,C接种方式:注意不要漏液,否则会损失细胞数量D饲养环境:要求是SPF条件 具体操作1.能不能成瘤，首先要考虑你的肿瘤细胞系能否成瘤，其次关键是你的肿瘤细胞数，一般肿瘤细胞存活力还是蛮高的，所以你重点要考虑细胞数的问题，但最高不要超过1*107。2.接种时间，最好在1小时之内完成。但在我实际操作过程中，裸鼠的数量又多，1小时

3、之内根本做不完的，所以你可以预先将细胞放在冰盒里暂为保存。效果还是不错的。3.成瘤时间，每个肿瘤细胞不太一样，细胞数合适，一般一周左右应该能出来了；另外，如果你是打皮下，你要考虑是否有打到深层组织，比如肌肉，那即使成瘤了，也不大好摸出来。腹腔注射1、腹腔注射进针的位置在腹中线与小鼠两后肢上沿连交叉以下的位置。2、腹腔注射很少会打到肠管，因为肠子在碰到硬物时会缩起来，当然前提是你的进针不是特别深，如果你的整个针头都扎入了腹腔，那么肠子是无处可躲了。3、腹腔注射进针后，你可以将针头左右摆动一下，如果是正确的，这时会有一种很自由无障碍的感觉，进针角度撑握在小于45度，针头进入长度不超过3厘米左右。用

4、大、小白鼠做实验时，以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推 0.51.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液（图2-5），为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。若实验动物为家兔，进针部位为下腹部的腹白线离开1cm处。肿瘤倍增时间 肿瘤动物实验模型肿瘤的倍增时间（doubling time），应该是在瘤体积100800之间计算，但是一组动物有10只，每周测量2次瘤体积，如果我想计算从200倍增到400的时间的话，10只动物不会在我测量体积的时候正好到200或400，那么，在计算的时候，具体应该怎么做？Geddes 等29将结

5、节倍增时间的计算公式表示为：DT =（ln 2 t）/ln（V2/V1），V1、V2分别是前后两次测量的体积， t是两次测量的时间间隔你的问题有歧义，我觉得可以有几下几种理解：1.测量的时候，对于某个老鼠来说，第一次可能测出来的体积是189.26（不是正好200），第二次是415.31（不是正好400），对于其他的动物都有这样的问题， 2.对于十只老鼠来说，测量的时候，可能1号老鼠是189.26，2号是312.57，3号是110.89.，这也是一种理解，我的意见是：测量一段比较长的时间，每只老鼠可以独立计算倍增时间，然后计算平均值，SD等，用统计学处理的手段。个体差异 同一批种几十只老鼠，有的

6、就长不出来，有的长得很大，使评价药效很困难。排除接种悬液未摇匀的可能后，还有什么原因可能造成这一点？可能是是个体差异了。其中，老鼠年龄是一个很大的因素。本人就遇到过2个月的老鼠接种肿瘤以后，有的长有的不长的情况。如果控制好试验条件，动物也比较均一的话，一般肿瘤生长都会很好的控制在一定范围的肿瘤模型新药申报zym145286做的肿瘤模型实验是用于新药申报用,现在有一些问题还不能校准,我做的是人癌模型,实验动物为裸鼠.1. 新药报批中,有明确的要求说肿瘤来源必须是体内传代3次以上吗?2. 实验结束后,对于取出肿瘤块的质量有没有明确的规定呢?还是跟其他种鼠一样,要求平均瘤重不小于1g或者不大于20%

7、的瘤快质量不小于400mg,3. 实验评价指标相对肿瘤增殖率T/C（%）,指的是瘤体积比还是瘤质量比?4. 实验申报材料是否需要附属实验动物裸鼠的照片?若需要附属的话,照片没有没有什么要求怎么照的，是鼠活的时候的照片还是实验结束后处死鼠后在摆好位置照?5. 申报材料中附图要求是肿瘤的生长曲线还是不同时间测量的T/C值对时间所做的曲线?还是两个都要有呢?6. 实验分组分5组,空白溶剂对照组,药物高中低三个剂量组,阳性药物有效浓度对照组. 这样可以吗?要是不可以,还需要怎么分呢?7. 实验材料中是否需要包含该实验动物血液相关指标的数值呢?比如:白细胞数量,骨髓的影响等等8. 一次实验有效后,是不是

8、也需要重复实验三次?那三次的数据都需要包含在数据中吗?swordzjsh具体问题回答如下：1.没有问题，新老原则均明确要求体内三代以上，并且不能超过1520代（人肿瘤）。2. 新原则已经没有瘤重的指标，只考察瘤体积，也没有对试验结束后的肿瘤大小有明确要求，但是老的指导原则有这方面的要求。3. 新的原则是指瘤体积，老的指瘤重，实际上在数据处理的时候一般瘤体积和瘤重的数据都会加入，分别计算相应的T/C。4. 需要，常见的有两种：一种是处死后摆放并拍摄整鼠照片，还有一种是剥取肿瘤后拍摄肿瘤的照片，还是那句话，最好都有，至少资料中放一个，另外一份备好，答辩的时候可以随时展示。另外，以前不允许数码拍摄，

9、要求光学照相机，以防电脑编辑，不知道现在还有没有类似的要求。5.有的人要看肿瘤生长曲线，有的人要看T/C的曲线，不过一般放生长曲线的多一些，记住，生长曲线现在要求RTV，相对肿瘤体积。以前报批的时候就可以放RTV曲线了，现在更是RTV的天下。6.一般来说，正式试验基本上就是这么设计了，但是你最好有这些剂量、疗程、给药途径等的设计依据，比如权威文献、你们的预试验等材料备问。当然，如果你的药物有些特别的地方，那么要根据他的具体特点设计试验。7. 这个是锦上添花的指标，对于药效试验来说，没有明确要求，但是一定要有体重和死亡的数据。8. 老原则要求重复两次，一共三次试验，新原则前几稿要求重复一次，一共

10、三次试验，但是最新一稿我没有看到对于重复试验的要求，但是作为药理研究的基本常识，重复试验是一定需要的，作为正式试验的重复试验应该把数据和结果分析都列入报告中，重复试验之间是同等重要的。zym145286:针对您的回答,我仍有几点不解1.实验结束后瘤的质量标准问题,您说新原则没有指标,那么老原则（就是现在还遵循的原则）具体是多少呢,能不能说明一下啊?2. T/C标准按照体积计算的时候,按照的是哪个时间点的体积呢,还是说整个测量过程的体积都要算?3.还有一个比较基本的问题,不要笑话我了，呵呵,那个RTV是怎样算出来的?是用药组数据减去空白组数据吗?还是其他算法?4.正式实验中,每组的动物数量是多少

11、?6只,还是10-12只?5.对给药时间有没有什么具体要求呢,就是说有没有上限,比如不可以超过一个月啊什么的?swordzjsh1. 老原则的标准就是你写出来的那个。2. 整个测量过程的体积都要算，可以用T/C对时间点作图的那种。实际上，不知道你有没有老的指导原则，上面有一个表，那个表里面汇总了一些试验的基本信息，那个表里面要填增殖率，一般是选效果最好的那一天的数据填上去。3. RTV = Vt / V0。其中V0为分笼给药时（即d0）测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。RTV是针对每一只小鼠计算的。4. 对于裸鼠来说，5到10 只，要根据你的药物的性质来定，如果SD较大，建议多设

12、几只，容易做出统计差异。如果SD较小，不少于6只，因为要求试验过程中动物死亡率不超过20%，6只动物死了一只还可以接受，要是5只动物死了一只就是20%了。5. 没有具体的要求，一般在3到5周，常见为三周，并且保证肿瘤长到足够的大小。如果有特别的原因可以变化试验周期，但是一般都是加长而不会缩短。实验分组与标记baobaogao197759: 我的实验是观察药物对lewis肺癌的生长的影响。 1、实验分为五组（模型组、阳性对照组（CTX）药物大、中、小剂量组）。我不清楚需不需要设置阴性对照组（就是不造模组，）2、C57小鼠怎样标记，有剪趾、穿耳孔的方法。但是具体的操作没有说明，能否介绍一下。1.不

13、需要设normal组，因为肿瘤的生长和评价非常明显，不会有干扰的可能。2. 我一般是剪耳号，一只小鼠两只耳朵，每只耳朵可以剪上侧和下侧两个位点，你可以自己指定组合，比如我们是这样的：左上为一号，左下为二号，右上为三号，右下为四号，左侧上下为五号，右侧上下为六号，左上右上为七号，左下右下为八号.细胞悬浮液体roger150 ,在做肿瘤模型用细胞接种时,细胞悬浮在什么液体里面.有没用matrigel同细胞混匀后再接种的?Swordzjsh:一般来说，可以悬浮在相应的无血清培养基、PBS、saline中，接种效果以上三种次第降低。用matrigel是一种促进肿瘤形成生长的手段，如果本身肿瘤生长不是特

14、别困难不建议用它，但是一些比如A549之类的细胞株，接种后五六十天还只有600700mm3的肿瘤，就可以考虑使用matrigel。使用matrigel的时候要注意低温操作，因为室温下mareigel就有可能固化。一般是在冰浴中操作。白血病肿瘤,皮下注射or静脉注射？abaiabai我的理解是，静脉注射反应的是疾病全身播散的作用，皮下注射便于观察瘤块大小，衡量用药效果，应该结合自己试验的目的选择注射方法juanr7213我最近刚刚实验比较了一下静脉注射和皮下接种白血病细胞株，从理论上说静脉接种似乎皮下接种更接近白血病的生物行为特点，但是根据我的实验和以前的文献，静脉接种小鼠的平均生存期很短，我的

15、不超过10天，我还试验性的进行了化疗，结果几乎全死了，而皮下接种者结果稳定。所以选皮下还是静脉，应该根据自己的试验目的来定，长期的实验好像不太适合用静脉注射的方法。皮下或者静脉注射都可以，看你的细胞株了，也有用腹腔注射的。小鼠的捉拿从笼盒内将小鼠尾部捉住并提起，放在笼盖（或表面粗糙的物体）上，轻轻向后拉鼠尾，在小鼠向前挣脱时，用左手拇指和食指抓住两耳和颈部皮肤，无名指、小指和手掌心夹住背部皮肤和尾部，并调整好动物在手中的姿势。这类捉拿方法多用于灌胃以及肌肉、腹腔和皮下注射等。如若进行心脏采血、解剖、外科手术等实验时，就必须要固定小鼠。使小鼠呈仰卧位（必要时先进行麻醉），用橡皮筋将小鼠固定在小鼠

16、实验板上。如若不麻醉，则将小鼠放人保定架里，固定好保定架的封口。小鼠性情较温顺，一般不会咬人，比较容易抓取固定。通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其它粗糙表面上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤，将小鼠置于左手掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾部，即可将小鼠完全固定。在一些特殊的实验中，如进行尾静脉注射时，可使用特殊的固定装置进行固定,如尾静脉注射架或粗的玻璃试管。如要进行手术或心脏采血应先行麻醉再操作,如进行解剖实验则必须先行无痛处死后再进行。实验动物的编号编号的方法很多，根据动物的种类数量和观察时间长短等因素来选择合适的标记方法。（一）挂牌法：将号码烙压在圆形

17、或方形金属牌上（最好用铝或不锈钢的,它可长期使用不生锈）,或将号码按实验分组编号烙在栓动物颈部的皮带上，将此颈圈固定在动物颈部。该法适用于狗等大型动物。（二）打号法：用刺数钳（又称耳号钳）将号码打在动物耳朵上。打号前用蘸有酒精的棉球擦净耳朵，用耳号钳刺上号码，然后在烙印部位用棉球蘸上溶在食醋里的黑墨水擦抹。该法适用于耳朵比较大的兔、狗等动物。（三）针刺法：用七号或八号针头蘸取少量碳素墨水，在耳部、前后肢以及尾部等处刺入皮下，在受刺部位留有一黑色标记。该法适用于大小鼠、豚鼠等。在实验动物数量少的情况下，也可用于兔、狗等动物。（四）化学药品涂染动物被毛法：经常应用的涂染化学药品有涂染红色：0.5中

18、性红或品红溶液。涂染黄色：3-5苦味酸溶液。涂染黑色：煤焦油的酒精溶液。根据实验分组编号的需要，可用一种化学药品涂染实验动物动物背部被毛就可以。如果实验动物数量较多，则可以选择两种染料。该方法对于实验周期短的实验动物较合适，时间长了染料易退掉；对于哺乳期的子畜也不适合，因母畜容易咬死子畜或把染料舔掉。（五）剪毛法：该法适用于大、中型动物，如狗、兔等。方法是用剪毛刀在动物一侧或背部剪出号码，此法编号清楚可靠，但只适于短期观察。（六）打孔或剪缺口法：可用打孔机在兔耳一定位置打一小孔来表示一定的号码。如用剪子剪缺口,应在剪后用滑石粉捻一下,以免愈合后看不出来。该法可以编至1 9999号，此种方法常在

19、饲养大量动物时作为终身号采用。实验动物的分组 （一）分组的原则：进行动物实验时，经常需要将选择好的实验动物按研究的需要分成若干组。动物分组应按随机分配的原则，使每只动物都有同等机会被分配到各个实验组与对照组中去，以避免各组之间的差别,影响实验结果，特别是进行准确的统计检验,必须在随机分组的基础上进行。每组动物数量应按实验周期长短、实验类型及统计学要求而定。如果是慢性实验或需要定期处死动物进行检验的实验，就要求选较多的动物，以补足动物自然死亡和认为处死所丧失的数量，确保实验结束时有合乎统计学要求的动物数量存在。（二）建立对照组：分组时应建立对照组。1.自身对照组：是指实验数据而言。实验动物本身在

20、实验处理前、后两个阶段的各项相关数据就分别是对照组和实验组的实验结果，此法可排除生物间的个体差异。2.平行对照组：有正对照组和负对照组两种。给实验组动物某种处理，而给正对照组用同样方法进行处理，但并不采用实验所要求的药物或手段，负对照组则不给任何处理。3.具体分组时，应避免人为因素, 随机把所有的动物进行编号，然后令其双数为组（实验组）,单数为B组（对照组）即可或反之。如果要分若干个组时，应该用随机数字表示进行完全随机分组。动物采血采血方法的选择，决定于实验的目的所需血量以及动物种类。凡用血量较少的检验如红、白细胞计数、血红蛋白的测定，血液涂片以及酶活性微量分析法等，可刺破组织取毛细血管的血。

21、当需血量较多时可作静脉采血。静脉采血时，若需反复多次，应自远离心脏端开始，以免发生栓塞而影响整条静脉。例如，研究毒物对肺功能的影响、血液酸碱平衡、水盐代谢紊乱，需要比较动、动脉血氧分压、二氧化碳分压和血液pH值以及 K+、Na+、CI-离子浓度，必须采取动脉血液。 采血时要注意：采血场所有充足的光线；室温夏季最好保持在25-28，冬季，15-20为宜；采血用具有采用部位一般需要进行消毒；采血用的注射器和试管必须保持清洁干燥；若需抗凝全血，在注射器或试管内需预先加入抗凝剂. 采动物品种 最大安全采血量（ml） 最小致死采血量（ml） 小 鼠 0.2 0.3 小鼠采血方法1.割（剪）尾采血 当所需

22、血量很少时采用本法。固定动物并露出鼠尾。将尾部毛剪去后消毒，然后浸在45左右的温水中数分钟，使尾部血管充盈。再将尾擦干，用锐器（刀或剪刀）割去尾尖0.3-0.5cm，让血液自由滴入盛器或用血红蛋白吸管吸取，采血结束，伤口消毒并压迫止血。也可在尾部作一横切口，割破尾动脉或静脉，收集血液的方法同上。每鼠一般可采血10余次以上。小鼠每次可取血0.1ml，大鼠0.30.5ml。2.鼠尾刺血法 大鼠用血量不多时（仅做白细胞计数或血红蛋白检查），可采用本法。先将鼠尾用温水擦拭，再用酒精消毒和擦拭，使鼠尾充血。用7号或8号注射针头，刺入鼠尾静脉，拔出针头时即有血滴出，一次可采集1050mm3。如果长期反复取

23、血，应先靠近鼠尾末端穿刺，以后再逐渐向近心端穿刺。3.眼眶静脉丛采血 采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部（大鼠采血需带上纱手套），应防止动物窒息。当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈（34cm）硬质玻璃滴管（毛细管内径0.5-1.0mm），使采血器与鼠面成45的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。刺入浓度，小鼠约23mm，大鼠约45mm。当感到有阻力时即停止推进，同时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于

24、颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。 若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。左右两眼轮换更好。体重20-25g的小鼠每次可采血 0.2-0.3ml；体重200-300g大鼠每次可采血0.5-1.0ml，可适用于某些生物化学项目的检验。4.断头取血 采血者的左手拇指和食指以背部较紧地握住大（小）鼠的颈部皮肤，并作动物头朝下倾的姿势。右手用剪刀猛剪鼠颈，约1/2-4/5的颈部前剪断，让血自由滴入盛器。小鼠可采用约0.81.2ml;大鼠约5-10ml。5.心脏采血 鼠类的心脏较小，且心率较快，心脏采血比较困难，故少用。活体采血方法与豚鼠相同。若做开胸一次死亡采血，先将动物

25、作深麻醉，打开胸腔，暴露心脏，用针头刺入右心室，吸取血液。小鼠约0.5-0.6ml；大鼠约0.8-1.2ml。6.颈动静脉采血 先将动物仰位固定，切开颈部皮肤，分离皮下结缔组织，使颈静脉充分暴露，可用注射器吸出血液。在气管两侧分离出颈动脉，离心端结扎，向心端剪口将血滴入试管内。7.腹主动脉采血 最好先将动物麻醉，仰卧固定在手术架上，从腹正中线皮肤切开腹腔，使腹主动脉清楚暴露。用注射器吸出血液，防止溶血。或用无齿镊子剥离结缔组织，夹住动脉近心端，用尖头手术剪刀，剪断动脉，使血液喷入盛器。8.股动（静）脉采血 先由助手握住动物，采血者左手拉直动物下肢，使静脉充盈。或者以搏动为指标，右手用注射器刺入

26、血管。体重15-20g 小鼠采血约0.2-0.8ml，大鼠约0.4-0.6ml。实验动物用药量的确定及计算方法（一）动物给药量的确定1. 先用少量小鼠粗略地探索中毒剂量或致死剂量,然后用小于中毒量的剂量，或取致死量的若干分之一作为应用剂量，一般可取1/101/5。2. 植物药粗制剂的剂量多按生药折算。3. 化学药品可参考化学结构相似的已知药物， 特别是化学结构和作用都相似的剂量。4. 确定剂量后，如第一次用药的作用不明显，动物也没有中毒的表现,可以加大剂量再次实验。如出现中毒现象，作用也明显，则应降低剂量再次实验。在一般情况下，在适宜的剂量范围内，药物的作用常随剂量的加大而增强。所以有条件时，

27、最好同时用几个剂量作实验，以便迅速获得关于药物作用的较完整的资料。如实验结果出现剂量与作用强度之间毫无规律时，则更应慎重分析。5. 用大动物进行实验时，防止动物中毒死亡,开始的剂量可采用鼠类的1/151/2,以后可根据动物的反应调整剂量。6. 确定动物给药剂量时，要考虑给药动物的年龄大小和体质强弱。 一般说确定的给药剂量是指成年动物的，如是幼龄动物，剂量应减小。如以狗为例：6 个月以上的狗给药剂量为1份时，36个月的给1/2份， 4589日的给1/4份，2044日的给1/8 份，1019日的给1/16份。7. 确定动物给药剂量时，要考虑因给药途径不同，所用剂量也不同。 以口服量为100时，皮下

28、注射量为3050，肌肉注射量为2030，静脉注射量为25。（二）人与动物的用药量换算方法人与动物对同一药物耐受性不同，一般动物的耐受性要比人大，单位体重的用药量动物比人要高。必须将人的用药量换算成动物的用药量。一般可按下列比例换算：人用药量： 1 小鼠、大鼠： 50100兔、豚鼠： 1520狗、猫： 510以上系按单位体重口服用药量换算。如给药途径为静脉、皮下、腹腔注射，换算比例应适当减小些。实验动物给药途径和方法（一）皮下注射注射时以左手拇指和食指提起皮肤，将连有5（1/2）号针头的注射器刺入皮下。皮下注射部位一般狗、猫多在大腿外侧，豚鼠在后大腿的内侧或小腹部；大白鼠可在侧下腹部。兔在背部或耳根部注射。蛙可在脊背部淋巴腔注射。（二）皮内注射皮内注射时需将注射的局部脱去被毛，消毒后，用左手拇指