NK细胞对人鼻咽癌细胞CNE2裸鼠皮下移植瘤的抑制作用Word文档下载推荐.docx

1、效靶比51、101、201、301时，NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为（）%、（）% and （）%。对照组和NK细胞治疗组肿瘤出现时间分别为（）d、（）d，（）,成瘤率分别为100、%，对照组和NK细胞治疗组裸鼠的瘤重分别为（）g、（）g，（），NK治疗组的抑瘤率为%。肿瘤组织石蜡切片病理学鉴定为低分化鳞状上皮细胞癌，NK细胞治疗组可见角化肿瘤细胞，较多的淋巴细胞浸润和大量细胞坏死区。结论 NK细胞对鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤有明显的抑制作用，有希望成为治疗鼻咽癌的新方法。【关键词】 鼻咽癌；自然杀伤细胞；裸鼠；移植瘤；杀伤细胞免疫球蛋白样受体；细胞治疗 鼻咽癌是我国南方常见的恶性肿瘤，早期

2、患者采用放射治疗常能取得较好的治疗效果，晚期患者放射治疗联合化学治疗虽能提高局部控制率，但未能提高总体生存率1。异基因骨髓移植中供受者之间杀伤细胞免疫球蛋白样受体 配体错配（KIR 配体错配）引发的同种异体反应性NK细胞活性可以防止白血病细胞复发，使NK细胞的抗肿瘤治疗作用日益得到医学研究者的重视。此前我们的体外实验表明同种异体NK细胞对CNE2细胞具有较强的杀伤活性。本研究以同种异体NK细胞为效应细胞，观察其对人鼻咽癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响，为鼻咽癌的治疗探索一种新的方法。 1 材料和方法 材料 分离NK细胞用的缓冲液（磷酸盐缓冲液，加入%BSA，2mmol/lEDTA，Milteny

3、i Biotec公司产品），CD56 MicroBeads （Miltenyi Biotec公司产品），RPMI 1640（Gibco公司产品），淋巴细胞分离液（上海试剂二厂产品），rhIL2、PHA （Sigma公司产品），人鼻咽癌细胞株CNE2购于军事医学科学院。方法NK细胞的分离纯化 采用常规密度梯度离心法分离3例健康人外周血单个核细胞，PBS洗涤2次，计数细胞，CD56 MicroBeads作MACS细胞阳性分选，获得CD3CD56+细胞即为NK细胞。细胞培养 细胞培养基为含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100g/ml链霉素的RPMI 1640。培养NK细胞时加入1 000U/

4、ml rhIL 2，PHA 10g/ml。CNE2细胞表面HLA A、B、Cw基因分型 采用PCR SSP法，按PCR SSP A、B、Cw特异性引物试剂盒说明操作。KIR基因分型 采用PCR SSP法，按KIR基因分型试剂盒说明操作。动物实验裸鼠 选取体重1520g的46周BALB/c裸鼠12只，分2组，每组6只，雌雄各半，在第一军医大学SPF动物实验中心饲养。裸鼠接种 对数生长期的CNE2细胞经胰酶消化、离心收集、计数后重悬于无血清RPMI 1640培养基中，配制成每含1106个肿瘤细胞的悬液，用1ml注射器将细胞悬液注射于BALB/c裸鼠背部皮下，NK细胞治疗组，NK细胞悬于无血清RPM

5、I 1640培养基中计数，配制成每含3107个细胞的悬液，用1ml注射器将细胞悬液经尾静脉注射于BALB/c裸鼠体内（每例健康者的NK细胞分别注射2只BALB/c裸鼠），尾静脉注射NK细胞与皮下注射CNE2细胞同一天进行。肿瘤生长情况监测及肿瘤的病理变化观察 自细胞注射之日起，观察两组裸鼠成瘤时间、成瘤率，待肿瘤出现后用游标卡尺测量肿瘤块2个方向的直径,分别记为、，肿瘤体积计算公式：V=1/2ab2。肿瘤出现后3周处死裸鼠，测肿瘤重量,计算肿瘤生长抑制率：肿瘤生长抑制率（1-处理组肿瘤重量/ 对照组肿瘤重量）100 。肿瘤标本称重后,常规福尔马林固定,石蜡包埋,5m连续切片,分别行HE染色，观

6、察病理变化。统计学方法 应用软件进行数据处理，数据以s表示，采用独立样本t检验。2 结果NK细胞的纯度 流式细胞仪检测CD3CD16+CD56+细胞的纯度为（CNE2细胞表面HLA A、B、Cw基因分型结果 CNE2细胞表面HLA A、B、Cw表型为A2, 24；Cw4, 7。KIR基因分型 3例健康人均表达KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2。NK细胞对CNE2细胞的体外杀伤活性 效靶比51、101、201、301时，NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分虽为%。肿瘤的生长情况 单纯接种CNE2细胞组和CNE2+NK细胞治疗组，肿瘤出现时间分别为（）d，（），NK细胞治

7、疗组成瘤时间较CNE2细胞组明显延长。NK 细胞抑制CNE2移植瘤的生长 实验结果表明NK细胞能有效抑制肿瘤细胞生长， 生长曲线显示NK细胞能明显减缓CNE2细胞BALB/c裸鼠体内移植肿瘤的生长速度，见图1。 图1 NK细胞对CNE2移植肿瘤生长的影响 各组裸鼠瘤重、抑瘤率 CNE2细胞组和CNE2+NK治疗组裸鼠的肿瘤重量分别为（）g ，（）。NK细胞治疗组肿瘤抑制率为。肿瘤组织病理改变 成瘤组织经HE病理切片鉴定为低分化鳞状上皮细胞癌，细胞呈多边形，细胞核卵圆形或不规则形，核仁较明显，核分离相多见。NK细胞治疗组可见角化肿瘤细胞，较多的炎性细胞浸润和大量细胞坏死区，见图2。 3 讨 论

8、NK细胞是机体内重要的淋巴细胞亚群, 在肿瘤免疫中NK细胞构成了第一道杀伤防线。NK细胞表面的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体（iKIR）与靶细胞表面特定的HLA I 类分子结合抑制NK细胞的活性，靶细胞缺乏iKIR特定的配体（KIR 配体错配）将激发NK细胞对靶细胞的杀伤活性。不同的iKIR分子识别并结合不同的HLA I 类分子。KIR2DL1识别HLA Cw2、Cw4、Cw5、Cw6；KIR2DL2/2DL3识别HLA Cw1、Cw3、Cw7、Cw8；KIR3DL1识别HLA Bw4；KIR3DL2识别HLA A3，A11；其余的KIR配体尚未明确。KIR2DL1、KIR2DL2/2DL3、

9、KIR3DL1、KIR3DL2是目前已知的影响NK细胞同种异体反应性的主要抑制性受体。 本研究表明CNE2细胞表面HLA A、B、Cw表型为A2，24、B18，35、Cw4，7，不表达Bw4、A3、A11分子，因此3例健康个体体内表达KIR3DL1、KIR3DL2的NK细胞与CNE2细胞之间存在KIR 配体错配现象。KIR3DL2为NK细胞的框架基因，任意个体的NK细胞均表达KIR3DL2，因此任意个体的NK细胞均与CNE2细胞之间存在着KIR 配体错配现象。 NKG2D是介导NK细胞杀伤活性的主要活化性受体，表达在所有NK细胞上，靶细胞表面的MICA/MICB分子是NKG2D的主要活化性配体

10、，MICA/ MICB与受体NKG2D结合后可以激活NK细胞对表达MICA/MICB分子的肿瘤细胞的杀伤。 我们的研究表明，CNE2细胞表面表达NK细胞活化性受体NK2D的配体MICA/MICB等，结合KIR检测结果表明，任意个体的NK细胞均存在杀伤CNE2细胞的分子基础，体外杀伤实验显示NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性在效靶比301时为（ 本研究中动物实验表明, NK细胞治疗组成瘤时间较CNE2细胞组明显延长，治疗组肿瘤体积较对照组明显减小，NK细胞治疗组肿瘤抑制率为，成瘤组织病理学证实两组均为低分化鳞状上皮细胞癌，NK细胞治疗组较对照组可见角化肿瘤细胞,有明显的淋巴细胞浸润和肿瘤坏死区，表

11、明NK细胞能有效抑制CNE2移植瘤的生长。 本研究提示NK细胞能有效抑制CNE2裸鼠移植瘤的生长,为鼻咽癌的治疗提供了另一种方法，但尚需大规模的体内实验，为临床应用提供充分的依据。【参考文献】 1 Chua DT, Sham JS , Au GK, et al. Concomitant chemoirradiation for stage nasopharyngeal carcinoma in Chinese patients : results of a matched cohort analysis“J“.Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2002, 53（2）:

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13、007，34：233 236.“4“ Vanhaesebroeck B, Mareel M, Van Roy F, et al. Expression of the tumor necrosis factor gene in tumor cells correlates with reduced tumorigenicity and reduced invasiveness in vivo“J“. Cancer Res,1991,51: 2229 2238.“5“ Mivechi NF, Dewey WC. DNA polymerase alpha and beta activities du

14、ring the cell cycle and their role in heat radiosensitization in Chinese hamster ovary cells “J“. Radiat Res, 1985, 103（3）: 337 350.“6“ Ruggeri L, Capanni M, Mancusi A, et al. Alloreactive natural killer cells in mismatched hematopoietic stem cell transplantation “J“. Blood Cells Mol Dis, 2004, 33（3

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