现代生化技术习题及答案Word文档下载推荐.docx

1、、 pH 和 浓度差 等。6.水溶液法提取酶和蛋白质时， 要注意控制好盐浓度、温度、pH 值 等因素。7.沉淀分离技术包括盐析 沉淀、 等电点沉淀和有机溶剂沉淀等技术。8.在分段盐析中，在一定的pH 和温度条件下，改变离子强度称为Ks 分段盐析，而在一定的盐和离子强度条件下， 改变温度或 pH 值称为分段 盐析。9.实验室进行蛋白质盐析沉淀时应用最多、最广的盐是硫酸铵。10.在核蛋白提取时，应选用0.14mol/L的氯化钠溶液提取核糖核蛋白，而选用 1mol/L 的氯化钠溶液提取脱氧核糖核蛋白。11.核酸分离时从 pH5 沉淀中可分离得到tRNA12.RNA 的提取方法主要有 稀盐溶液 提取和

2、 苯酚水溶液 提取。13.苯酚水溶液提取核酸时，蛋白质 和 DNA 沉淀于 苯酚 层中，而RNA 和 多糖 溶解于 水层 中。14. 核酸沉淀分离主要有 有机溶剂沉淀法 、 等电点沉淀法 、 钙盐沉淀法和 选择性溶剂沉淀法四种方法。15. 能够选择性地沉淀DNA的试剂是异丙醇三、问答题1进行细胞破碎的方法有哪些： 机械破碎法：是通过机械运动所产生的剪切力的作用使细胞破碎的方法。物理破碎法：用各种物理因素 （温度、压力、超声波 ）的作用使细胞破碎的方法。化学破碎法：用化学试剂可使细胞膜结构改变或破坏，改变细胞膜的通透性。酶学破碎法：通过加入酶或利用细胞本身的酶的作用，使细胞破碎的方法。2蛋白质和

3、酶提取、分离的一般原则： 提取、分离方法条件要温和使目的蛋白质和酶的活性和功能不受损害尽量尽早除去各种杂质、脂类、核酸及毒素。设法除去变性的和不需要的蛋白质。设法提高目的蛋白质的含量或生物活性。分离纯化要在缓冲溶液中进行。建立灵敏、特异、精确的检测方法。根据其存在的部位、分子结构及溶解性质的不同选择不同的提取方法。3实验室进行蛋白质盐析沉淀时应用最多、最广的是硫酸铵，它的优缺点是什么：优点：它在水中溶解度大；其溶解度受温度的影响较小；价廉易得；不易引起蛋白质变性； 分离效果比其它盐好。 缺点：缓冲能力差； NH4+ 离子会干扰蛋白氮的测定。4核酸提取要注意的原则： 防止核酸酶的降解 : 在提取

4、分离核酸时要降低核酸酶的活性， 通常加入抑制剂和去激活剂。 防止化学因素的降解 : 避免强酸强碱。防止物理因素的降解 : 核酸大分子、高温、机械作用等均可以破坏核酸分子的完整性，因此核酸提取适于在低温及避免剧烈搅拌等条件下进行。第二章 层析分离技术1.层析分离技术：是利用混合物中各组分的物理、 化学性质（分子的形状和大小、分子的极性、吸附力、分子的亲和力、分子的分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在两相中， 当流动相流过固定相时， 各组分以不同的速度移动，而达到分离的技术。2.吸附层析： 是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中的各组分分离的技术。3.解吸作用： 在一定条件下，被吸

5、附物离开吸附剂 表面的现象称为解吸作用4.洗脱：加入解吸附剂，使物质从固定相上分离下来的方法。5.分配层析： 是利用各组分的分配系数不同而予以分离的方法。6.分配系数：是一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时， 该溶质在两相溶剂中的浓度比值。7.薄层层析： 是将固定相的支持剂均匀地铺在支持板上，成为薄层，把样品点在薄层上，用适当的溶剂展开，从而使样品中各组分达到分离的一种层析技术。8.气相层析： 是一种以气体为流动相的一种高效、快速的层析分离技术。9.担体：是固定相的“载体”或“固体支持，物”大多为多孔性固体颗粒。10.死时间： 从进样到出现空气峰最高峰的时间。11.保留时间： 从进样到

6、出现色谱峰最高点所需的时间。12.校正保留时间： 指样品组分的保留时间与进样到出现空气峰最高值的时间之差。13.死体积 ：指从进样到出现空气峰最高值时所通过的载气体积14.保留体积： 指从进样到出现组分浓度最高峰时所通过的载气体积15.校正保留体积： 指保留体积与死体积之差16.定量校正因子： 是单位峰面积中某物质的量17.离子交换层析： 是利用离子交换剂上可解离基团 （活性基团 ）对各种离子的亲和力不同而达到物质分离的一种层析分离技术18.凝胶层析： 又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。是用高交联度的固体凝胶按照物质分子量大小进行分离的技术。19.洗脱体积： 某一组分物质从加样到层析最高峰

7、出现时所需的洗脱液总体积。20.亲和层析： 是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的技术。 21. 配基：又称为“配体。”指亲和层析中作为固定相的一方。1. 层析分离技术按流动相状态可分为 液相 层析和 气相 层析；按分离过程所主要依据的物理化学性质分为 吸附层析、分配层析、离子交换 层析、 分子排阻 （凝胶过滤 ） 层析、 亲和 层析等。2. 洗脱方法根据所用洗脱剂不同分为 溶剂洗脱法 、 置换法 （取代法） 、 前缘分析法 （前缘洗脱法 ） 。3. . 聚酰胺薄膜层析只适用于 极性分子 的分离。4. 纸上层析是以滤纸纤维 的 结合水 为固定相，以 有机溶剂 作为流

8、动相，展开时样品中各物质在两相之间不断地进行分配，由于各物质有不同的分配系数 、 移动的速率 也就不同，从而达到分离的目的。5. 溶质在滤纸上移动的速度可用 Rf 值表示， Rf = 溶质斑点中心移动的距离溶剂前沿移动的距离 ，Rf 值决定于 分配 系数，不同的物质在两相间的 分配系数 不同， Rf 值也不同，由此可根据 Rf 值的大小对物质进行定性分析。6. 薄层层析中用的薄层板有 硬板 （湿板 ） 与 软板 （干板 ） 之分，常用的薄层板制作方法有浸涂 法、 喷涂 法、 倾斜涂布法 法和推铺法 法。气相层析根据其固定相的不同可分为气固层析和气液层析两种。气相层析具有分辨率高、分析速度快灵敏

9、度高和 应用范围广 等特点。9. 气固层析的固定相为固体，其分离的主要依据是吸附剂 对被吸附物的吸附力 不同，所以又称为气相吸附层析；气液层析的固定相为液体，其分离的主要依据是 分配系数的不同，又称为气相分配层析。气相层析的流动相是气体 ，称为载气，常用的有 氢气氮气氦气氩气等。载气的选择主要根据所使用的检测器和载体气流决定。红色担体用于分离非极性和 弱极性物质；白色担体用于分离极性物质12.气相层析时，样品在进柱前必须变为气体， 有些物质难于气化必须先将其转变为 易挥发 的衍生物再进行气相层析。13. 进行气相层析时，应注意控制好 气体流量 、 进样温度 、 进样时间和进样量。14. 热导池

10、检测器属于 浓度型检测器检测器 ，其灵敏度比热导池检测器高氢焰检测器属于 质量型 倍左右，是目前应用最广泛的检测器之一。15. 离子交换层析的操作过程包括上柱 （加样 ） 、 洗脱 和 收集 、树脂再生三大步骤。16. 凝胶装柱时必须注意柱中不能有 气泡 或 裂纹 存在三、问答题：1.选择吸附剂时应注意的问题： 吸附剂应有适当的吸附力和尽量大的表面积；对被分离物有足够的分辨率，对不同物质的吸附力不同；对被吸附物的吸附应是可逆的，一定条件下可解吸、洗脱；不溶于所用的溶剂中，不引起被吸附物化学变化；颗粒均匀，操作时稳定，不会破裂。2.选择洗脱剂时应注意的问题： 不与吸附剂起化学反应， 且不使吸附剂

11、溶解；对样品的各组分溶解度大、粘度小、流动性好；不与各组分起化学反应，且易与被洗脱组分分开；纯度高，无杂质影响。3.纸层析时对滤纸的选择有何要求： 滤纸的厚薄程度、纤维的松紧度不同，使与滤纸纤维结合的水量不一样，两相的体积比也不同。得到的 Rf 值也不相同。滤纸中的杂质也会影响 Rf 值。因此，层析时对滤纸的要求较高：由高纯度的棉花制成，质地均一、厚薄一致、纤维松紧度适中、有一定的机械强度。4.在纸层析前，滤纸和层析装置为什么要先用层析溶剂平衡：层析前滤纸与层析装置用溶剂系统的蒸气饱和。不平衡时滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，使溶剂系统的组成发生改变，导致溶剂前沿不齐，影响层析

12、效果和 R值。5.担体应具备哪些条件： 表面积大；孔径分布较均匀；表面无催化或吸附性能；与固定液或被分析的物质不起化学反应；热稳定性好；有较好的机械强度。6.离子交换剂选择时应考虑哪些因素： 样品离子带何种电荷阴离子只能被阴离子交换剂吸附，阳离子只能被阳离子交换剂吸附；离子的浓度 浓度大时，选择交换容量大的交换剂型号被分离物质相对分子量的大小 分子量大时要求交联度低，分子量小时选择较高交联度更好；离子与交换剂亲和力的大小 选择不同型号的交换剂，既要考虑吸附，还要考虑便于洗脱；样品物质及交换树脂的物理化学特性 根据其对酸、碱、温度的敏感情况，控制好环境条件。7.试述凝胶层析的基本原理： 凝胶是一

13、种多微孔的多孔径网状支持物组成进行分子过滤的分子筛；物质分子在层析柱中的运动有重力的垂直方向运动和无定向扩散的布郎运动；大分子物质不能进入微孔在凝胶空隙间快速流出层析柱；小分子能够进入微孔，因而在凝胶中许多孔中穿行，因通过的距离长，后流出层析柱；分子直径越小能够进入的孔越多，流出层析柱越慢；根据分子筛这一原理可依据物质分子直径的大小按照由大到小的顺序流出层析柱而得到分离。因此，它是一个反筛。第三章 电泳技术一、名词解释：1. 电泳：是带电粒子在电场中向着与本身所带电荷相反的电极移动的现象。2.泳动度： 泳动度 （）带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度3.薄层电泳： 是将支持物与缓冲液调制成适当厚

14、度的薄层而进行电泳的技术4.凝胶电泳：是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持物的电泳技术。5.等电聚集电泳： 是在电泳系统中，加进两性电解质载体。当通以直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的 pH 梯度。当不同等电点的分子进入这个体系时， 各自聚集到与其等电点相当的 pH 位置上，从而使不同等电点的分子得以分离的电泳技术。1.按所使用的支持体的不同分为 纸 电泳、 薄层 电泳、 薄膜 电泳、 凝胶电泳和 等电聚焦 电泳。按支持介质的形状分为 平板 电泳和 柱状 电泳。2.分子在电场中移动的方向决定于所带电荷 的种类，带正电荷的向的 负极移动；带负电荷的向正极 移动； 静电荷为

15、零的分子在电场中不移动。 分子在电场中移动的速度主要决定于于颗粒所带净电荷的量，同时受分子的大小和形状的影响。3.影响电泳的外界因素有电场强度、 溶液的 pH 值 、溶液的离子强度 、 电渗 以及缓冲液的粘度和温度。凝胶电泳与其他电泳的主要区别，在于凝胶电泳同时具有电荷效应分子筛效应的双重作用，具有很高的筛选效率 。聚丙烯酰胺凝胶电泳按其凝胶系统的组成可分成连续 凝胶电泳 、 不连续 凝胶电泳、 梯度 凝胶电泳和SDS 凝胶电泳。不连续电泳的凝胶由上至下可分为样品胶、 浓缩胶分离胶 。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，其迁移率主要取决于它所带的电荷 以及分子的大小和形状在聚丙烯酰胺系统中加入 SD

16、S ，则蛋白质分子的迁移率主要取决于其相对分质量，而与它的所带的电荷及分子的形状无关。在聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳系统中不仅具有电荷效应效应和分子筛效应 效应，而且还具有浓缩效应效应，因此比连续电泳系统具有更高的分辨率和区带清晰度。1.试述聚丙烯酰胺凝胶具有哪些的优点： （）在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； （2） 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； （3）对 pH 和温度变化较稳定； （4）几乎无吸附和电渗作用，只要 Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； （5） 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达 10-6g ；（6）凝胶孔径可调节， 根据被分离

17、物的分子量选择合适的浓度 ,通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； （7） 分辨率高 ,尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。 因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。2.等电聚集电泳具有哪些优缺点： 优点： 分辨率高； 随电泳时间增加区带越来越窄；样品加在任何部位都可以聚焦到等电点 pH 位置；很稀的样品都可分离，且重现性好；可用于测定多肽或蛋白质的等电点。缺点：要求使用无盐溶液，但某些蛋白质在无盐溶液中溶解度低，易产生沉淀。对一些在 pI 不溶解或发生变性的蛋白质不适用。3.对载体两性电解质有什么要求： 在 pI 处必须有足够的缓冲能力，以便控制 pH 梯

18、度。在 pI 处必须有足够的电导，以便使一定电流通过。而且，各不同 pI 值的载体有相同的电导系数，使整个体系中电导均匀，获得均匀的电场。相对分子质量要小， 以便在聚焦后能容易地和蛋白质组分分开。 化学组分不同于被分离物质， 以免干扰测定。 不与被分离物质起化学反应， 也不会引起被分离物质变化。第四章 离心分离技术1.离心分离技术： 是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度、浮力等因素的不同而使物质分离的技术。2.沉降系数：指在单位离心作用下， 粒子的沉降速度。单位：S （ Sverdberg ）, 1S=1 10 13 cm/s2.差速离心：采用不同的离心速度和离

19、心时间， 使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。4.密度梯度离心：是样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。5.等密度梯度离心：是不同的颗粒在离心力的作用下，不同浮力密度的物质颗粒向下沉降或向上漂浮，一起移动到它们各自浮力密度恰好相等的位置（等密度点 ），形成区带的方法。 （又称为平衡等密度离心 ）。6.相对离心力 （ RCF ） ：指颗粒所受的离心力 （c）与地心引力 （重力 Fg ） 之比二、填空1.通常按离心机转速的不同，将其分为常速离心机 、 高速离心机和 超速离心机三种。 P81常速离心机的转速通常在8000r/min 以内，高速离心机的转速在

20、10000-25000r/min，转速大于25000r/min 的离心机称为超速离心机。在超速离心中，离心方法可分为差速离心、 密度梯度离心等密度梯度离心 。P824.物质颗粒在离心场中所受离心力 （ Fc ）的大小，决定于颗粒的 质量（m） 和离心加速度 离心加速度（c ）。三、问答题 1.根据离心方法的不同， 离心时间所表达的含义有什么区别：离心时间是影响离心效果的主要因素之一，其概念按离心方法不同有所差别。差速离心的离心时间：指某种颗粒完全沉降到离心管底的时间。又称澄清时间、沉降时间。密度梯度离心的离心时间：指形成界限分明的区带的时间。等密度梯度离心的离心时间：指颗粒完全到达等密度点的平

21、衡时间。第五章 化学检测技术1.化学检测技术：是根据物质的化学性质而对物质进行定性、定量测定的方法2.蛋白质的免疫化学检测：利用抗原与抗体之间特异的结合而对蛋白质进行定性定量分析的技术称为蛋白质的免疫化学检测技术。3.抗原：能刺激动物机体产生抗体，并能特异地与这种抗体结合的物质。4.抗体：是在动物体内对于抗原的反应而产生的能特异性地与这种抗原结合的一类免疫球蛋白。5.抗原决定簇：蛋白质的抗原特性是由蛋白质的化学结构决定的，蛋白质多肽链的一部分或某些特定的基团可与抗体结合，称为抗原决定簇或抗原的决定基。6. 凝集反应：细胞性抗原与相应的抗体相混合时，就会凝集成团，这种抗原 -抗体反应称为凝集反应

22、。7.抗血清的效价：免疫血清在一定量抗原存在下，能显现明确的沉淀反应的最大稀释度的倒数。8.抗体的沉淀反应：将可溶性抗原 （蛋白质 ）与相应抗体混合，当两者的比例适当，并有适当的盐类存在时，可形成沉淀，这种现象叫抗体的沉淀反应。9.免疫扩散：是利用蛋白质在半固体基质上的扩散作用，使抗原和抗体在浓度比例合适的部位产生沉淀带或沉淀环， 从而检测蛋白质的方法。 10. 免疫电泳：将免疫扩散和电泳技术结合起来检测蛋白质的技术。1.糖类的化学检测主要是利用游离羰基 的 还原 性与试剂进行氧化还原反应而进行测定的。糖类的化学检测中，最常用的试剂是斐林试剂，其基本组成是由 A 液和 B 液两液组成， A 液

23、的主要成分是CuSO4，B 液主要由酒石酸钾钠NaOH组成。糖液滴入斐林试剂中时， 酒石酸钾钠铜是一种氧化剂，可与还原糖的游离 羰基发生 氧化还原反应，生成 红 色的氧化亚铜沉淀。蛋白质的含氮量几乎是恒定的，平均含氮量为16%，只要测出蛋白质含氮量，乘以6.25，即为蛋白质的含量。5.在蛋白质是由多种 氨基酸 以 肽键 相互联接而成的，在一级结构中可发现，它的主链中， 肽 键占 1/3 ，没有任何一种物质含 肽 键量如此丰富。因此，可用一些该键所能发生的反应，对蛋白质进行测定。6. 凯氏定氮的主要步骤有： 消化 、 蒸馏 、 滴定 与 计算 。7. 双缩脲反应是指蛋白质在 碱性 溶液中与 Cu2+ 结合，生成 紫红色 络合物的反应。8. 一般氨基酸与茚三酮反应生成 紫色 化合物，而亚氨基酸反应后生成 黄色 化合物。9. 抗体是一类 免疫球蛋白 ，由两条 重链 和两条 轻链 通过多个二硫键 连接成 Y 型，抗体分子的 N 端是抗体与抗原决定簇的结合部位，它决定了抗体的特异性，当抗原决定簇与抗体的N 端结合时，产生变构效应，使C 端的某些部位结构改变，而产生一系列的免疫效应10. 利用免疫化学检测蛋白质的方法主要有凝集反应和沉淀反应。11.