一个新的具有特殊结构和潜在趋化活性Word格式文档下载.docx

1、基于以上研究结果，我们设计了一条新的技术路线来发现新的细胞因子。利用抑制性减数杂交技术，从PHA刺激的U937细胞中克隆到能被IL-10所抑制的cDNA序列，其中一个序列编码一个新的分泌性细胞因子，含有CC家族趋化因子所具有的特征性结构即两个连续的半胱氨酸，并对多种白细胞具有趋化作用，该因子被命名为趋化素样因子1（CKLF1）。但是，该因子与其它CC家族趋化因子有如下区别：（1）CKLF1成熟蛋白质只有一个连续的CC结构，其羧基端没有其它的半胱氨酸；（2）CKLF1与已发现的其它CC家族趋化因子没有明显序列上的同源性； （3）CKLF1至少存在其它三种不同的RNA剪切形式；（4）它对骨骼肌细胞

2、有刺激作用。CKLF1可能代表一个新的家族的趋化因子。因此，我们将其命名为趋化素样因子1，其相应的变异体命名为CKLF2，CKLF3和CKLF4。材 料 和 方 法抑制性减数杂交（SSH）SSH的操作方法按Diatchenko报道的进行操作（5）， 用CLONTECH公司的 PCR-Select TM cDNA Subtraction Kit。SSH技术把抑制性PCR（Suppression PCR）和传统的减数杂交方法相结合（16），可用于比较两个群体的mRNA，得到在一组mRNA中表达，而在另一组mRNA中低表达或不表达的基因。先将mRNA反转录为cDNA，其中含有特异表达基因的样本为te

3、ster，另一组为driver，tester和driver cDNA杂交，去除杂交体cDNA，没有形成杂交体的cDNA即是在tester中特异表达或高表达的基因，而在driver中不表达或低表达的基因。抑制性PCR在选择性扩增特异基因的同时，抑制自身的扩增，使杂交阳性率更高。在SSH操作过程中，人前单核细胞系U937细胞由本室长期传代培养。细胞培养在含10%胎牛血清 ，100U/ml青链霉素的RPMI1640培养基中。用于SSH操作的U937细胞批量培养至2107细胞，离心收集细胞, 用Hanks液洗三遍后悬于含10ng/mlPHA的10% FCS RPMI1640中, 其中一半即1107细胞

4、作为tester, 另一半细胞中加入终浓度为100ng/ml的IL-10作为driver。继续培养8小时后收集细胞， 提取mRNA，取2 gmRNA合成双链cDNA，用RsaI切后，将tester分为两组，在T4 DNA连接酶作用下，分别连上Adapter1和Adapter2，进行两轮杂交，杂交产物用作PCR扩增的模板。将杂交产物稀释1000倍，利用试剂盒提供的PCR引物，进行第一轮PCR，扩增27轮，然后将第一轮PCR产物稀释10倍，分别以NESTED PCR引物1和 NESTED PCR引物2R进行第二轮PCR，扩增15轮，得到的扩增产物即为差异基因片段，Glassmilk回收200160

5、0bp的片段，克隆到pGEM-T easy中，连接产物转化XL-Blue菌，选白色克隆。得到约100个克隆，随机筛选15个变大明显的克隆，纯化质粒DNA，用ALF快速测序仪进行序列分析，并在NCBI中进行序列同源性比较。生物信息学将来自PHA刺激的U937细胞文库的EST片段与GenBank TBLASTN 的EST数据库进行比较。将与CKLF1片段有高度同源性的序列（50个以上碱基，95%以上同源性），通过 EST Assembly Machine （http:/www.tigem.it）. 进行EST拼接（6）。用于CKLF1拼接的EST片段的登记号为 W38899, N95062, AA

6、429945, AA987264, AA927461, W19056, N89912, AA516431, AA479657, AA455042, AA989129, AF151058，NM-016951，W52820。在PHA刺激的U937细胞中得到CKLF1的全长序列，测序证明EST拼接正确。CKLF1可能的信号肽切割位点分析用PcGene、Prosite软件和 Signal P server （http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）进行分析。CKLF1的染色体定位用HTGS数据库分析（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov）。包含CKL

7、F1基因的两个染色体片段的登录号为AC010542和AC018557。Northern Blot分析我们对目的基因的表达情况进行了Northern Blot分析，细胞总RNA的提取用生命公司的TRIZ0LTM试剂提取。分别取20 g tester或driver RNA，在1.5%的甲醛变性胶中电泳，通过毛细管吸引法将RNA转到尼龙膜上。探针的标记和杂交操作参照DUPONT公司Random Primer Fluorescein Labeling kit with Antifluorescein-HRP （DuPont NEN NELMGC-803）试剂盒说明书。标记探针的核苷酸均为来源于SSH杂

8、交得到的全长EST片段（CKLF1全长cDNA片段中的53-530位碱基）。寡核苷酸用于扩增CKLF1及其变异体的全长cDNA片段的引物为： P1 5 GCA, AGA, AGC,GGG, AAG, CCG, A 3和P2 5 GGA, AGA, ATA, CAG, AAA, TAT, GTT, TAA, TAC 3； 用于扩增CKLF1及其变异体的编码区cDNA片段以构建pCDI-CKLF1的引物为： P3 5 ATG, GAT, AAC, GTG, CAG, CCG, AAA, AT 3和P4 5 TTA, CAA, AAC, TTC, TTT, TTT, TTC, ATG, C 3； 用

9、于扩增不含终止密码的CKLF1及其变异体的cDNA片段，以构建pEGFP-N1-CKLF1, pEGFP-N1-CKLF2 和 pEGFP-N1-CKLF4的下游引物为： P5 5 CGG GAT CCA AAA CTT CTT TTT TTT CAT GC 3CKLF1表达谱分析用巢式PCR的方法对CKLF1及其变异体在各种不同组织中的表达水平进行分析，用Clontech公司Multiple Tissue cDNA Panels试剂盒提供的单链cDNA文库作模板，利用P1，P2和P3，P4引物，进行PCR扩增。在第一轮PCR反应中，取1lcDNA文库作模板，反应体系为25l，进行25个循环；

10、在第二轮PCR反应中，取1l第一轮PCR产物作模板，反应体系为25l，进行20个循环。取10l第二轮PCR产物，在5%SDS-PAGE胶中电泳。质粒构建为了对CKLF1， CKLF2和CKLF4的亚细胞定位进行研究，将去终止码的相应序列克隆到表达载体pEGFP-N1中。用P3和P5引物，从PHA刺激的U937细胞cDNA文库中，扩增CKLF1，CKLF2和CKLF4的cDNA序列，在P5引物中，终止码被去除，并引入BamH1酶切位点。PCR产物用Klenow酶处理为平端，然后用BamH1酶切。pEGFP-N1载体先用EcoRI酶切，再用Klenow酶处理为平端，然后用BamH1酶切。酶切处理后

11、的载体片段和目的基因片段回收后，连接得到重组质粒pEGFP-N1-CKLF1，pEGFP-N1-CKLF2和pEGFP-N1-CKLF4。用P3和P4引物从PHA刺激的U937细胞cDNA文库中，扩增CKLF1的 ORF片段，克隆入pGEM-T载体中，测序。用EcoRI将插入片段释放出来，连接至经EcoRI切后，并用CIP处理后的pcDI载体中，经酶切鉴定可得到CKLF-1的正义表达载体pcDI-CKLF1。pcDI是将pcDNA3的BglI-kpnI片段与pCI的BglI-KpnI片段置换后得到的一个真核表达载体（7）。转染和转染试剂在瞬时转染中， COS-7细胞在10%胎牛血清的DMEM中

12、培养。用SuperFect转染试剂，根据说明转染COS-7细胞。48小时后，收集转染上清，用于活性分析和Western blot分析。细胞用PBS洗，甲醛固定30分钟，再用PBS洗，荧光显微镜观察。CKLF1-EGFP，CKLF2-EGFP，CKLF3-EGFP在COS-7细胞上清中的Western blot分析将pEGFP-N1，pEGFP-N1-CKLF1, pEG FP-N1-CKLF2 和 pEGFP-N1-CKLF4四种质粒分别转染COS-7细胞，48小时后，各取70l细胞上清，进行SDS-PAGE电泳，电转至尼龙膜上，与抗EGFP多克隆抗体反应，再与HRP标记的二抗反应，用化学发光

13、的方法进行检测。趋化实验按照以前报道的方法（8），从健康成年志愿者外周血中分离嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。纯化的嗜中性粒细胞重悬于HBSS缓冲液中，细胞密度为1X106/ml；淋巴细胞和单核细胞重悬于含0.5%低内毒素BSA和20mM Hepes的1640培养液中，细胞密度分别为5X106/ml和2X106/ml。细胞趋化实验用48孔趋化小室，按照文献报道的进行（9）。小孔的下面装满COS-7细胞的转染上清，上面是各种不同类型的细胞。用于嗜中性细胞的聚炭膜孔径为3m，趋化时间为30分钟；用于单核细胞和淋巴细胞的聚炭膜孔径为5m，趋化时间为90分钟。DNA注射和肌肉切片分析所有的实验动物均

14、购自北京大学医学部实验动物部。将100gpcDI-CKLF1或pcDI分别溶于100l生理盐水中，取6-8周龄BALB/c小鼠，分别注射pcDI-CKLF1或pcDI于骨胳肌中，同时用40ms，80V电刺激，以提高质粒的摄取量（10）。10天后，处死小鼠，将注射质粒部位的肌肉取出。标本分为两部分，一部分用于常规组织学处理，分别进行Feulgen，ANAE，POX和HE染色。另外一部分用于提取RNA，进行RT-PCR分析。 结 果差异显示cDNA片段的获得利用SSH技术，我们从PHA刺激的U937细胞中得到了能被IL-10所抑制表达的cDNA序列。筛选了15个插入序列大于200个碱基的克隆，测序

15、，并在Genbank公共数据库中检索，发现其中6个克隆包括CKLF1为新基因。Northern blot分析再次证明白细胞介素10能够抑制CKLF1的表达，CKLF1约为600个碱基（见图1）。图1. CKLF表达的Northern blot分析第2和第4泳道的RNA来自PHA刺激的U937细胞；第1和第3泳道的RNA来自PHA刺激同时IL-10抑制的U937细胞。CKLF1在PHA刺激的U937细胞中的表达可被IL-10部分抑制（第1和第2泳道）。CKLF1全长DNA序列克隆及其编码蛋白质的特征通过SSH技术从PHA刺激的U937细胞中获得的CKLF1片段含有多聚腺苷酸尾巴和相对少见的加尾信

16、号ATTAAA，人趋化因子Eotaxin和TARC的加尾信号也是ATTAAA（11，12）。这表明该片段包含完整的3非翻译区（13，14）。该片段有一个编码99个氨基酸的完整开放读码框架，96-98位为翻译起始密码ATG，其周边序列为GCGATGG，符合Kozak规律（15）。在Genbank数据库中检索发现，CKLF1为一个新基因；但是EST数据库检索发现,来自不同cDNA文库的多条EST序列与我们得到的序列部分相同或高度同源。通过EST延伸技术，在CKLF1原有cDNA序列基础上，向5非翻译区延长了52个碱基。Northern blot显示CKLF1与预期的大小基本相符。为证明EST拼接是

17、否正确，我们设计了引物P1和P2，从PHA刺激的U937细胞中成功得到CKLF1的全长cDNA序列，DNA序列分析表明我们的EST拼接是正确的。CKLF1的全长cDNA序列及其编码的蛋白质序列如图2A所示（CKLF1在GenBank中的登录号为AF096895）。图2. CKLF1的核酸和相应的蛋白质序列及其与TARC和STCP-1的序列比较（A）CKLF1的核酸和蛋白质序列。核酸序列为正义链，从5到3方向。核酸序列下为相应的蛋白质序列，终止码用星号表示。（B）CKLF1的蛋白质序列与CC家族趋化因子TARC和STCP-1的比较。加深的为保守的氨基酸。CKLF1编码的蛋白质含有99个氨基酸，分

18、子量为10.9KDa，为高度碱性的疏水性蛋白质。CKLF1蛋白没有N糖基化位点，SignalP分析发现没有典型的信号肽切割位点（16，17），转基因分析和Western blot分析发现，CKLF1可被分泌到细胞上清中。其他实验室的研究发现，一些没有前导序列的蛋白质能被分泌出来，如乳腺来源的生长抑制因子，白细胞介素1和巨噬细胞移动抑制因子2等（18）。因此，CKLF1可能利用另外一种分泌机制。CKLF1在蛋白质水平上仅与线虫的amino acid permease蛋白有低水平的同源性，与其它蛋白质没有明显的同源性。CKLF1蛋白具有两个结构特性：（1）CKLF1仅有三个半胱氨酸，最后两个连续排

19、列，具有CC家族趋化因子的结构特征；（2）BLAST检索发现，CKLF1与其它CC家族趋化因子之间没有明显同源性。但是，手工排列发现，CKLF1与两个位于16号染色体上CC家族趋化因子TARC和STCP-1在CC附近有数个关键的氨基酸相同（图2B所示）。CKLF1三个变异体的克隆化通过RT-PCR技术，我们从PHA刺激的U937细胞中得到CKLF1的全长cDNA序列，同时，得到了其它三条片段，经克隆化和序列分析后，发现它们为CKLF1的三种变异体，分别命名为CKLF2（AF135380），CKLF3（AF135381）和CKLF4（AF145216）。在PHA刺激的U937细胞中，CKLF1比

20、CKLF2，CKLF3和CKLF4的表达水平高，且该基因的表达可被IL-10所抑制，因此Northern Blot检测时只看到一条带，可能因为其它变异体丰度较低，Northern Blot敏感度不够而未能检测到。读码框架分析表明：CKLF-2 、CKLF-3和CKLF-4分别编码152个氨基酸， 67个氨基酸和120个氨基酸，它们与CKLF1有相同的氨基端和羧基端， 中间27-112为氨基酸不同， 但都有CC结构。用编码最多氨基酸的CKLF2作参照， CKLF1，CKLF3和CKLF4分别缺失27-79，27-111，80-111位氨基酸（图3所示）。 图3. CKLF1、CKLF2、CKLF

21、3和CKLF4的蛋白质序列图4.人CKLF基因内含子和外显子交界处序列及CKLF1，2，3，4结构示意图（A）人CKLF基因内含子和外显子交界处序列。外显子序列用大写字母表示；内含子序列用小写字母表示。（B）CKLF对外显子的选择性应用及CKLF1，2，3，4的结构示意图。CKLF1与其变异体有相同的氨基端和羧基端。在CKLF2蛋白质的基础上，CKLF1，CKLF3和CKLF4选择性用27-79，27-111和80-111位氨基酸。下划线序列指CKLF2和CKLF4可能的穿膜区序列CKLF基因定位和结构通过检索HTGS数据库，将CKLF2全长cDNA序列与人类基因组工作草图相比较，我们发现两个

22、位于16号染色体上的片段与其有高度同源性。CKLF基因包括4个外显子和3个内含子。内含子和外显子交界处的序列符合真核细胞剪接规律（图4A）（19）。CKLF基因与cDNA序列比较发现，外显子1，2，3，4分别编码1-26，27-79，80-111，112-152位氨基酸（图4B）。CKLF1，2，3，4有共同的外显子1和4，选择性拥有外显子2和3。因此，它们为同一基因的不同剪接形式。CKLF1 mRNA在不同组织中的表达CKLF1 mRNA在PHA刺激的U937细胞中存在不同的变异体形式。我们用RT-PCR技术分析了CKLF1及其变异体在成年及胚胎组织中的表达情况，结果发现：CKLF1及其变异

23、体在脾脏、肺、睾丸、卵巢、外周血白细胞、胎盘、胰腺、胎脑、胎儿骨胳肌和心脏中高表达；成年人骨胳肌、肝脏、胸腺、结肠、前列腺、胎脾和胎肝中表达水平较低；而在成年人脑组织、肾脏、心脏、小肠、胎肺和胎肾中的表达几乎检测不到。在绝大多数组织中，CKLF1和CKLF2的表达水平相类似，均比CKLF4的表达水平高，而CKLF3的表达水平最低（图5所示）。图5.人CKLF1及其变异体在各种组织中的分布（A）CKLF及其变异体在胚胎组织中的表达。（B）CKLF及其变异体在成年组织中的表达。左边显示的分子量标准。CKLF1，CKLF2和CKLF4的亚细胞定位为了研究CKLF1，2，4的细胞定位，我们构建了CKL

24、F-EGFP融合表达载体，EGFP在CKLFcDNA序列的下游，二者位于同一读码框架。将融合表达载体和空载体对照分别转染COS-7细胞。荧光显微镜下观察荧光的分布。表达对照EGFP的细胞有分布均匀的亮绿色荧光，在细胞内没有特异性亚细胞定位（图6A）；而转染CKLF1-EGFP的细胞，细胞内荧光很弱（图6B）。基于CKLF1的结构特征，可以推测大部分CKLF1-EGFP蛋白可能被分泌到细胞培养上清中。相反，CKLF2-EGFP和CKLF4-EGFP主要位于细胞边缘，在细胞的其它位置，仅有很少的荧光分布（图6C和6D）。转染HEK-293细胞，也得到相似的结果，这表明CKLF1，CKLF2和CKL

25、F4的亚细胞定位不仅局限于COS-7细胞。图6.EGFP、CKLF1-EGFP、CKLF2-EGFP和CKLF4-EGFP融合蛋白的亚细胞定位EGFP位于CKLF1，CKLF2和CKLF4的羧基端，它们在同一读码框架上，瞬时转染COS-7细胞，荧光显微镜观察。（A）转染EGFP对照。（B）转染CKLF1-EGFP。（C）转染CKLF2-EGFP。（D）转染CKLF4-EGFP。放大倍数为400倍。CKLF1为分泌性表达从CKLF1的亚细胞定位结果来看，我们推测CKLF1可能为分泌性表达。为证明这一点，收集COS-7细胞转染上清，进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。Weste

26、rn blot表明在pcDI-CKLF1-EGFP转染细胞中，有一条约38KD的特异表达带，分子量与CKLF1-EGFP融合蛋白相吻合（图7）。而在其它三组转染上清中，没有检测到特异的表达带。因此，我们可以得出以下结论：虽然CKLF1的信号肽尚有待确定，但CKLF1为分泌性蛋白，在细胞上清中检测不到CKLF2-EGFP和CKLF4-EGFP的存在。而且，计算机分析发现，CKLF2和CKLF4的27-79位氨基酸为高度疏水性氨基酸，可能是穿膜蛋白。将CKLF2序列递交到GenBank后，发现了其他两个实验室克隆的序列，与CKLF2有相同的读码框架，其中一个的登录号为AF057306，被认为是穿膜

27、蛋白脂，这提示CKLF2可能是穿膜蛋白。图7.应用抗EGFP多克隆抗体，在COS-7细胞上清中检测CKLFs/EGFP。第一泳道：高分子量蛋白质标准；第二泳道：EGFP；第三泳道：CKLF1/EGFP；第四泳道：CKLF2/EGFP；第五泳道：CKLF4/EGFP重组CKLF1在体外的趋化活性为了研究CKLF1的生物学活性，我们构建了CKLF1真核表达质粒pcDI-CKLF1，该质粒包括CKLF1的完整读码框架。我们将pcDI-CKLF1和空载体pcDI分别转染COS-7细胞，收集细胞上清，进行趋化活性分析。重组CKLF1的趋化活性分析用穿孔移动分析法，趋化活性用趋化指数表示（趋化指数是指pc

28、DI-CKLF1转染细胞上清组的细胞数与空载体pcDI转染细胞上清组的细胞数的比值）（20）。与pcDI转染细胞上清相比较，pcDI-CKLF1转染细胞上清对人中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞有明显的趋化活性（图8所示）。我们在果蝇S2细胞系统中得到相似的实验结果，这说明CKLF1的趋化活性不仅局限于COS-7细胞系统。CKLF1体内趋化活性我们将pcDI-CKLF1裸质粒注射到BALB/c小鼠肌肉中，10天后，取注射部位肌肉组织，RT-PCR分析发现CKLF1的表达水平较高；同时，肌肉纵切，Feulgen染色，发现与空载体对照组相比，注射pcDI-CKLF1裸质粒的小鼠肌肉切片中有更多的细胞浸

29、润。这表明CKLF1能引起白细胞的聚集或能刺激干细胞的增殖或二者兼而有之。为进一步验证CKLF1的体内趋化活性，我们又对部分肌肉切片进行POX或ANAE染色，然后用HE复染（21）。如图9D和图9F所示，许多细胞呈POX或ANAE强阳性，而在图9C和图9E中，没有发现相应的阳性细胞。众所周知，POX阳性细胞主要是嗜中性粒细胞，而ANAE阳性细胞主要为单核细胞和T淋巴细胞（22）。在细胞染色的基础上，结合形态学观察，CKLF1在体内能够趋化嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，这与CKLF1的体外趋化活性一致。图8.CKLF1对白细胞的趋化作用将人外周血淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞置于趋化小室中

30、，下面孔中加入不同稀释度的COS-7细胞转染上清。在高倍镜下，随机选5个视野，计数穿膜细胞的数量。CI：趋化指数。图9.小鼠肌肉内注射pcDI-CKLF1引起的白细胞浸润A、C、E为注射pcDI组小鼠；B、D、F为注射pcDI-CKLF1组小鼠。注射质粒10天后，取肌肉组织，作组织切片。D和F中可见白细胞浸润。CKLF1在体内引起骨胳肌的形态学改变将肌肉组织固定后，分别作纵切片和横切片，HE染色。在表达CKLF1的肌肉组织中，除了观察到多细胞浸润现象外，还发现了肌肉组织的形态学改变，如图10所示。在横切面中，CKLF1组有细胞核居中现象（图10B），而对照组没有这种现象（图10A）；在纵切面中，CKLF1组细胞核成串珠状排列（图10D）。这种现象说明肌卫星细胞被活化，肌肉处于再生状态（23）。目前，尚需进一步的实验来证明这是CKLF1的直接作用还是由被趋化细胞产生的细胞因子导致的