全国艾滋病检测技术规范修订版文档格式.docx

1、蒋岩、汪宁、李敬云、钟平、尚红、邵一鸣、肖瑶、朱红、邢文革、姚均、潘品良、邱茂锋、马艳玲、梁姝、郭志宏、王哲、葛红卫、王盈、李金明、徐晓琴、常文辉、吴建军、张福杰、吴昊、苏雪丽、廖玲洁。本规范参加编写主要国际机构：世界卫生组织（Po-lin CHAN、张岚）。美国疾病预防控制中心GAP项目（ Colin Shepard、郝玲、齐明山）。本规范编写工作联系人：肖瑶。本规范自发布之日起实施，同时终止全国艾滋病检测技术规范（2009年版）。本规范适用于全国艾滋病检测实验室。本规范解释权属于中国疾病预防控制中心。致谢：感谢盖茨基金会在规范修订过程中给予技术和人力等方面的支持。第一章 样品的采集和处理1

2、 范围本章规定了用于人免疫缺陷病毒（HIV）检测的全血、血清、血浆、细胞、口腔黏膜渗出液、尿液以及滤纸干血斑（DBS）样品的采集和处理方法，适用于HIV抗体、抗原、核酸、基因亚型、耐药检测、CD4+和CD8+T淋巴细胞数测定及HIV分离培养。2 规范性文件引用艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准中华人民共和国卫生行业标准 WS -293有效版本。艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测质量及保证指南（中国疾病预防控制中心，2013年版）。HIV-1病毒载量测定及质量保证指南（中国疾病预防控制中心，2013年版）。HIV-1基因型耐药检测及质量保证指南，（中国疾病预防控制中心，2013年版）

3、。Consolidated Guidelines on HIV Testing Services. WHO July 2015.可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定，卫生部第45号令,2006年2月1日。3 样品种类及相应的用途 3.1 全血、血清、血浆、口腔黏膜渗出液、尿液以及干血斑样品可用于HIV抗体检测。3.2 全血、血清、血浆、病毒培养上清液可用于HIV抗原检测。3.3 抗凝全血可用于CD4+和CD8+T淋巴细胞测定。3.4 血浆、DBS可用于HIV-1病毒载量、基因型、耐药检测。3.5 淋巴细胞富集液、外周血单核淋巴细胞（PBMC）及全血可用于HIV核酸定性与定

4、量、基因型检测和HIV-1分离培养。4 操作步骤4.1 采样前准备根据检测项目的具体要求，确定采集样品的种类、处理、保存及运输的时限和方法，按照临床采血技术要求操作，遵守生物安全相关要求。检查所需物品是否已备齐，是否在有效期内，有无破损，是否足量，特别应检查受检者信息与样品容器表面的标记是否一致，并注明样品采集时间及唯一编码。采集血液样本宜选择合适的室内（外）采血空间，受检者坐（卧）于合适的位置，准备采血用具、皮肤消毒用品、采血管及试管架、硬质废弃物容器等。口腔黏膜渗出液样本应使用试剂盒提供的专用采样工具，尿液样本建议使用可保持尿液稳定的专用采尿管。4.1.1 样品的编码和记录4.1.2 应制

5、定样品编码的标准操作程序（SOP），规定样品编码的原则和方法，为样品制定唯一性编码（编号），保证其唯一性。4.1.3 采血前，先对试管或滤纸进行标记，核对后编码。要将标签贴在试管的侧面，推荐使用预先印制好的、专门用于冷冻储存的耐低温标签。干血斑滤纸应使用具有资质的产品。4.1.4 口腔黏膜渗出液样本应采集口腔渗出液,不是唾液。4.1.5 尿液样本准备好带有唯一编码的采尿管，并保留唯一编码。4.1.6 应使用专门的样品记录本或登记表记录样品，同时录入电脑保存。4.2 样品的采集和处理4.2.1 血液4.2.1.1 抗凝全血：消毒局部皮肤，用加有抗凝剂（EDTA钠盐或钾盐、枸橼酸钠、肝素钠）的真空

6、采血管抽取适量静脉血，或用一次性注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管中，轻轻颠倒混匀68次，备用。4.2.1.2 末梢全血：消毒局部皮肤（成人和1岁以上儿童可选择耳垂、中指、无名指或食指。1岁以下儿童采用足跟部）。用采血针刺破皮肤，用无菌纱布擦掉第一滴血。收集滴出的血液，备用。4.2.1.3 血浆：将采集的抗凝全血15003000r /min离心15分钟，上层即为血浆，吸出置于合适的容器中，备用。4.2.1.4 血清：根据需要，用不含抗凝剂的真空采血管抽取510ml静脉血，或一次性注射器抽取静脉血，转移至无抗凝剂的试管中，室温下自然放置12小时，待血液凝固、血块收缩后再用15003000r

7、/min离心15分钟，吸出血清，置于合适的容器中，备用。4.2.1.5 淋巴细胞富集液：将采集的抗凝全血15003000r/min离心15分钟，吸取血浆层下的淋巴细胞富集液，置于合适的容器中，备用。4.2.1.6 PBMC：使用淋巴细胞分离液，进行密度梯度离心，吸出PBMC层，置于合适的容器中，备用。4.2.1.7 抗凝剂的选择：根据检测要求选用适当的抗凝剂，如CD4+和CD8+T淋巴细胞测定可选用EDTA钠盐或钾盐、枸橼酸钠、肝素钠；HIV-1病毒分离、核酸定性/定量检测可选用EDTA钠盐或钾盐或枸橼酸钠。4.2.1.8 样品采集后处理、保存、运输的时限和条件，因不同的检测项目而异，应参见不

8、同检测项目要求。4.2.1.9 采血完成后的穿刺针头必须丢弃于放置尖锐危险品容器内，妥善处理，防止发生职业暴露。4.2.2 滤纸干血斑4.2.2.1 根据需要，可将采集的各种血液样品制备成滤纸干血斑，用于检测。最常用的是用抗凝全血、末梢全血和血浆制备滤纸干血斑。4.2.2.2 用移液器从样品管中吸取100L抗凝全血（或血浆），对准滤纸印圈的中心处，将样品滴在滤纸上，或将穿刺后自皮肤伤口流出的末梢全血直接滴加在滤纸印圈的中心处。4.2.2.3 根据需要，连续在数个印圈上滴加样品。4.2.2.4 于室温下自然干燥至少4小时（潮湿气候下至少干燥24小时），不要加热或堆叠血斑，勿与其它界面接触。4.2

9、.2.5 血斑充分干燥后，将其放入密封袋中，每张干血斑单独保存，避免血斑之间的相互污染，同时放入干燥剂及湿度指示卡，密封包装，保存备用。4.2.3 尿液和口腔黏膜渗出液4.2.3.1 尿液：推荐使用专用采尿管，保持尿液稳定。尿液样品可采集随机尿，女性经期应取中段尿。4.2.3.2 口腔黏膜渗出液：使用试剂盒提供的容器收集样品。存放时间和是否冻存以试剂盒说明书为准。口腔黏膜渗出液应采集口腔渗出液,不是唾液。4.3 样品的保存4.3.1 用于抗体和抗原检测的血清或血浆样品，短期（1周）内进行检测的可存放于28，一周以上应存放于-20以下。4.3.2 用于核酸检测的血浆和血细胞样品4天内进行检测的可

10、存放于4，3个月以内应存放于-20以下。3个月以上应置于-70以下保存。4.3.3 口腔黏膜渗出液样品应即刻使用，需要保存应以产品说明书为准。4.3.4 尿液样品，使用专用采尿管，室温下可保存2周，一年之内存放宜在28。长期保存（一年以上）的样本冻存条件、是否添加防腐剂等以产品说明书为准。4.3.5 用于CD4+T淋巴细胞检测的全血样品，室温保存，时间不超过24小时。如果用CD45设门，样品保存不超过72小时。4.3.6 筛查阳性样品应及时进行补充试验，筛查阴性样品，可根据具体需要决定保存时间，建议至少保存1个月。特殊用途或专项项目的样品根据具体要求确定保存时间。补充试验阳性样品按照国家生物样

11、品管理的有关规定执行。4.4 样品的运送4.4.1 全血、血浆的运送应符合生物安全要求，参照可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（卫生部第45号令,2006年2月1日执行）。4.4.2 血液样品运送时应采用三层容器对样品进行包装，随样品应附有与样品唯一性编码相对应的送检单。送检单应标明受检者姓名、样品种类等信息，并应放置在第二层和第三层容器之间。4.4.2.1 第一层容器：直接装样品，应防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的唯一性编码或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。4.4.2.2 第二层容器：容纳并保护第一

12、层容器，可以装若干个第一层容器。要求不易破碎、带盖、防渗漏、容器的材料要易于消毒处理。4.4.2.3 第三层容器：容纳并保护第二层容器的运输用外层包装箱。外面要贴上醒目的标签，注明数量、收样和发件人及联系方式，同时要注明“小心轻放、防止日晒、小心水浸、防止重压”等字样，还应易于消毒。4.4.2.4 用于抗体检测的血清和血浆样品应在冻存条件下运送用于CD4+和CD8+T淋巴细胞测定的样品应在室温下（1825）运送。用于病毒载量检测的样品应在-20以下运输。DBS和尿液样品应在室温下（1825）运送，可通过邮寄方式运送。4.4.2.5 运送样品必须有记录。4.5 样品的接收4.5.1 样品包裹必须

13、在具有处理感染性材料能力的实验室内、由经过培训的工作人员打开，打开包裹时应穿戴防护衣、戴口罩和防护眼镜，在生物安全柜中打开，用后的包裹应及时进行消毒。4.5.2 核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器消毒，同时报告实验室负责人和上一级实验室技术人员。4.5.3 检查样品的状况，记录血液样品有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。记录干血斑和尿液样品包装是否完整，如果污染过重或者不符合接收要求，应将样品安全废弃。并立即将样品情况通知送样人，要求重新采集样品。4.5.4 接收样品时应填写样品接收单。第二章 HIV抗体检测本章规定了H

14、IV抗体的检测方法、结果报告及质量控制。适用于各级各类医疗、疾病预防控制、检验检疫、采供血及卫生保健机构。可作为对HIV感染者诊断和监测的实验室依据。艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准（中华人民共和国卫生行业标准，WS293-有效版本）。Consolidated Guidelines on HIV Testing Services. WHO July 2015Statementfrom the Surveillance and Survey Working Group and the Laboratory Working Group to the Office of the Global AIDS

15、 Coordinator.26 Nov.2006.Guidelines for using HIV testing technologies in surveillance. UNAIDS/WHO.2009. 艾滋病病毒抗体快速检测技术手册（中国疾病预防控制中心，2011年版。3 HIV抗体检测实验室要求应符合国家对实验室生物安全的有关要求。实验室的质量控制按本规范相关章节规定执行。4 HIV抗体检测的目的和要点4.1 HIV抗体检测的目的4.1.1 HIV抗体检测可用于诊断、血液筛查、监测等。4.1.2 以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况，包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要

16、进行的体检等。4.1.3 以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。4.1.4 以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。4.2 HIV抗体检测的要点4.2.1 根据目的选择检测方法及检测策略。4.2.2 严格遵守实验室标准操作程序（SOP）。4.2.3 结果判定以试剂盒说明书为标准。4.2.4 筛查试验有反应，须作补充试验。 补充试验是通过检测样本中是否存在艾滋病病毒抗体、抗原或者核酸而确定艾滋病病毒感染的检测方法。补充试验包括抗体确证试验（免疫印迹试验，条带/线性免疫试验，特定条件*下的替代检测，免

17、疫层析或免疫渗滤试验）和核酸试验（核酸定性和核酸定量试验）。替代检测包括三种酶联免疫试验、三种快速试验或酶联免疫加快速试验* * 特定条件：高流行地区（流行率大于5%）、高危人群（如男男同性恋，吸毒人群）、三种试剂均经过使用地区中心实验室评价。4.2.5 筛查试验无反应，不应做补充试验。4.2.6 对筛查及补充试验对象均应做好咨询工作。5 常规HIV抗体检测方法5.1 试剂和样品必须是经国家食品药品监督管理总局注册批准、在有效期内的试剂。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的方法及试剂。样品可采用血清、血浆、全血、滤纸干血斑、口腔黏膜渗出液和尿液。5.2方法5.2.1 筛查方法5.2.1.1

18、酶联免疫吸附试验（ELISA）这类试验可使用血液（包含血清、血浆和滤纸干血斑）、尿液样品，ELISA多为HIV抗体检测试剂。HIV抗原抗体联合检测试剂可同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。HIV抗原/抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶标记的HIV抗原/抗体，加底物显色，用酶标仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。5.2.1.2 化学发光或免疫荧光试验（CIA/IFA）这类试验采用发光或荧光底物，可使用血液（包含血清和血浆）、尿液样品，既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体。HIV抗原/抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶或荧光标记的HIV抗原/抗体，加发光或

19、荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。5.2.1.3 快速检测（RT）及其它试验这类试验可使用血液、口腔黏膜渗出液，操作简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测、VCT及检测点等。一般可在1030分钟内得出结果。 明胶颗粒凝集试验（PA）：是HIV抗体检测的一种简便方法。将HIV抗原致敏的明胶颗粒，与待检样品作用。当待检样品含有HIV抗体时，明胶颗粒与抗体发生凝集反应，根据凝集情况判读结果。PA试剂有两种:同时检测HIV-1和HIV-2抗体以及分别检测HIV-1和HIV-2抗体。有效试验的阴性和阳性对照质控，需符合试剂盒的规定。免疫渗滤试验：斑点ELISA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验：均以硝

20、酸纤维膜为载体，HIV抗原点状或线状固定在膜上，加待检样品，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点或条带。反应时间在10分钟以内。有效试验的质控点必须显色。免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线状固定在膜上，待检样品沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控带必须显色。反应时间在30分钟以内。5.2.2 抗体确证试验5.2.2.1 免疫印迹试验（WB）WB可使用血清、血浆和滤纸干血斑。WB采用间接法检测样品中的抗HIV-1/HIV-2特异性抗体。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳把分子量大小不等的HIV-1蛋白分离开来，然后再把这些

21、分离的不同蛋白带转移到硝酸纤维素膜上（或PVDF膜）。将此膜切割成条状，每一膜条上均含有经电泳分离过的HIV抗原。待测样品经适当稀释后，加至硝酸纤维素膜上，恒温震荡，使其充分接触反应，血清中若含有HIV抗体，就会与膜条上抗原带相结合。加入抗人-IgG酶结合物和底物后，根据出现条带情况, 按照试剂盒说明书判定标准，判断待测样品为阳性、阴性或不确定。5.2.2.2条带/线性免疫试验（RIBA/LIA）RIBA/LIA采用间接法检测样品中的抗HIV-1/HIV-2特异性抗体。试剂盒的膜条上包被有HIV-1/HIV-2不同的重组抗原片段，加入待测样品后，其中的相应抗体与抗原发生特异性的免疫反应；随后加

22、入抗人IgG（碱性磷酸酶标记）与HIV特异性IgG抗体相结合；加入显色底物后，在碱性磷酸酶的催化下，特异性抗体的结合部位出现肉眼可见的条带, 按照试剂盒说明书判定标准，判断待测样品为阳性、阴性或不确定。5.2.2.3 其他方法： 可用于确证的特定条件下的三种酶联免疫、三种快速试验或酶联加快速试验，免疫层析和免疫渗滤试验。 6 结果报告6.1 筛查报告HIV抗体筛查试验报告使用附表1（HIV抗体筛查检测报告）。筛查试验无反应报告为“HIV抗体阴性”；有反应必须进行复检，复检两次检测均无反应报告为“HIV抗体阴性”，复检检测均有反应或一个有反应一个无反应需进行“补充试验”；报告为“HIV感染待确定

23、”，不能出具阳性报告。HIV抗体筛查报告需由一名检验人员和一名审核者签字。6.2 确证报告6.2.1 WB及 RIBA/LIA报告HIV抗体WB及 RIBA/LIA试验结果报告使用附表2（HIV抗体确证检测报告）。（1）符合HIV-1抗体阳性判断标准，报告“HIV-1抗体阳性”，并按规定做好检测后咨询和疫情报告。符合HIV-2抗体阳性判断标准，报告“HIV-2抗体阳性”，并按规定做好检测后咨询和疫情报告。（2）符合HIV抗体阴性判断标准，报告“HIV抗体阴性”。如疑似“窗口期”感染，建议进一步做HIV核酸检测或2-4周后随访，尽早明确诊断。（3）符合HIV抗体不确定判断标准，报告“HIV抗体不

24、确定”，在备注中应注明“2-4周后复检”或尽快做核酸检测。（4） HIV抗体确证检测报告应在收到样品后的7个工作日内发出。6.2.2 特定条件的用于确证的三种酶联免疫、三种快速试验或酶联加快速试验报告。见附表4。7 质量控制 7.1 酶免或发光法抗体检测的室内质量控制 7.1.1 试剂盒内部对照试剂盒内部对照质控品即为试剂盒内提供的阳性和阴性对照。试剂盒内部对照用于判断每次实验的有效性，不能作为室内质控品使用。每一次检测临床样品时，必须有试剂盒内部对照，而且只能在同批号的试剂盒中使用。如内部对照结果无效，必须重新试验。7.1.2 室内质控品为非试剂盒组份的外部质控品，是为了监控检测的重复性而设

25、置的，质控品定值必须为弱阳性。外部质控品的作用是判断该批临床样品检测的可信性。因此，每次实验必须包含室内质控品，出现失控时，必须重新试验。室内质控品可以购买或实验室自行制备。 质控品应稳定、无菌、且不含有影响试剂反应的防腐剂。7.1.3 Levey-Jennings质控图7.1.3.1 质控图参数外部质控品的均值和标准差应建立在实验室常规使用方法对外部质控品重复测定的基础上。一般采用在不同批次检测取得至少20个数据；如果仅做少量批次的检测，也至少做5个批次的检测，每个批次中不少于4个质控血清测定结果，以建立一个临时性的均值和标准差，当达到20批次数据后，替代临时性的均值和标准差。（1）算术平均

26、值（）：代表一组质控品测定S/CO值的均值。为了统计学上有显著性意义，应该采用至少20次（天）测得的外部对照质控品的S/CO值计算平均值。（2）标准差（s）：是描述样品与均数之间离散程度的一个指标，是与质控品S/CO值均值有关的预期范围。一组S/CO值的标准差以s表示。（3）变异系数（cv）：是反映各次S/CO值相对于均值离散程度的一个指标，可以用来衡量检测的重复性或精密度。（4）控制限：由实验室根据对外部质控品检测结果的均值和标准差来确定。例如，按照12S质控规则，控制限为外部质控品S/CO均值加减2个标准差；按照13S质控规则，控制限为外部质控品S/CO均值加减3个标准差。7.1.3.2

27、质控规则 实验室在报告结果之前必须评价质控数据，可通过图形记录的检查或由计算机审核结果来决定。目前有许多质控规则，常用的是12S和13S规则。（1）告警（12S）：当外部质控品的S/CO值超出+2s范围时，系统处于告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察。若将12S做失控标准，有较高的假失控概率，所以一般不采用。（2）失控（13S）：+3s范围时，系统处于失控状态，本次实验结果不能被接受，可能是系统误差、随机误差或外部质控品 稳定性下降所致。7.1.3.3 质控图的分析及失控处理实验室应建立质控图分析及失控情况处理的程序。 当出现失控时， 必须找出发生问题的原因，找出解除问题的方法，并消除原因。7.1.4 室内质控其他方式“即刻法”质控“即刻法”质控方法是在对