Con A结合型和PNA结合型肝癌血清糖蛋白表达谱的建立及其作为肿瘤标志物的研究好文档格式.docx

1、研究意义：肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居恶性肿瘤之首。当前，临床上的肝癌诊断多以检测肿瘤标志物（Tumor Marker, TM）结合影像学诊断为主要依据，只有在瘤体生长到一定体积才能诊断，而对于早期较小的瘤体诊断则有一定困难。常用的肝癌检测标志物甲胎蛋白（AFP），一般对晚期肝癌的诊断较为敏感，但也有约30%的阴性率，不适合作为普查或早期诊断。临床上被确诊的患者多数己属于中晚期，患者的存活率很低。故TM在肝癌患者的早期发现、早期诊疗中显得尤为重要1。糖蛋白中的糖链在细胞识别、信号传导、细胞分化等众多的生命活动中有着重要的生物学功能。糖蛋白中糖链的异常表达，与肿瘤的发生和转移密

2、切相关。糖链结构与肿瘤的研究已引起相当重视，特别是利用血清或尿液中一些糖蛋白糖链的异常表达来诊断恶性肿瘤，为癌症诊断开辟了一个“糖链标志”的新领域2，4。研究表明，肿瘤患者血清中糖蛋白大都是N-糖链，且发生了高甘露糖型糖链增多和岩藻糖基含量增加的变化9，12。如能结合蛋白质组学中高通量的分析检测技术，将有更多的TM被人们发现，为肝癌的早期诊治提供更多的思路和信息8，11。人血清中糖蛋白的含量和种类比较多，其糖链结构的微小变化往往是预示某种疾病尤其是肿瘤的重要信息4。因此，如何从成分复杂的血清中富集及纯化异常表达的糖蛋白是进行肝癌糖蛋白表达谱分析的基础和前提。凝集素是分离糖蛋白特有的手段，已广泛

3、用于分离和制备糖蛋白，并且可直接用于目的产物糖蛋白的分型5，7。因此，我们分别选用对高甘露糖型糖蛋白有特异性吸附作用的凝集素伴刀豆球蛋白（Con A）、对岩藻糖型糖蛋白有特异性吸附作用的花生凝集素（PNA）从成分复杂的血清中富集和纯化高甘露糖型糖蛋白及岩藻糖型糖蛋白。2-DE结合MALDI-TOF-MS分析对富集到的糖蛋白进行鉴定，通过比较正常人血清和肝癌血清ConA 结合型糖蛋白和PNA 结合型糖蛋白表达的差异，最终建立正常人血清和肝癌血清ConA 结合型糖蛋白和PNA 结合型糖蛋白表达谱，提高肝癌的早期诊断率，同时为肝癌的发病机制和治疗靶点的研究提供理论依据和信息。因为目前还未有一套完整可

4、靠的糖蛋白研究技术体系，因此本研究还旨在建立起一套重复性好、高通量、高灵敏度的蛋白质糖基化研究新方法，搭建起一套可靠的从分离纯化到结构解析糖基化蛋白研究技术体系。国内外研究现状及分析：（1） 我国肝癌发病率高，但早期检测率低在我国每年有11万人发生肝癌，占世界总发病率的42.5%，患者的存活率很低，近年来，发病率呈逐年上升的趋势。乙型肝炎病毒引起的肝炎进而慢性迁延导致肝纤维化、肝硬化，最终演变成肝癌，也是肝癌形成的主要原因之一。据有关报道，目前我国约有1.3亿乙肝病毒携带者，这个事实提示了肝癌高发病率的潜在危险性1。常用的肝癌检测生物标志物主要为AFP，一般对晚期肝癌的诊断较为敏感，且有30%

5、的阴性率，因此不适合作为普查或早期诊断15。故TM在肝癌患者的早期发现、早期诊疗中显得尤为重要。由于肿瘤基因的复杂性，没有一种肿瘤是单一类型的，故发现“高特异性、高敏感性、器官特异性”的理想TM十分困难。因此，肝癌筛查要选择适当的方法，提高其可操作性及人群依从性，多种TM联合检测可提高敏感性和准确性，如能结合蛋白质组学中高通量的分析检测技术，将有更多的TM被人们发现，为肝癌的早期诊治提供更多的思路和信息。（2） 糖蛋白的异常表达与肿瘤发生和转移密切相关糖基化是蛋白质翻译后修饰的主要修饰形式之一，约有一半以上的蛋白质发生了糖基化修饰。众多研究结果表明2，4，8，糖蛋白中糖链的异常表达，与肿瘤的发

6、生和转移密切相关，所以，目前临床应用的TM中绝大部分是糖蛋白，如AFP蛋白异质体（N-糖链）、FLP、CEA、糖蛋白抗原CA50、CA125等。糖链结构与肿瘤的研究已引起相当重视，特别是利用血清或尿液中一些糖蛋白糖链的异常表达来诊断恶性肿瘤，为癌症诊断开辟了一个“糖链标志”的新领域。因此，建立正常人血清和肝癌血清糖蛋白表达谱对我国这样一个肝炎、肝硬化、肝癌的高发病率国家具有重大意义。（3） 凝集素用于血清糖蛋白的富集和纯化凝集素是一类能与糖专一地、非共价地可逆结合的免疫球蛋白，类似于抗原抗体反应，不同的凝集素与不同的糖蛋白有不同的糖链结合域，并且可用于糖蛋白的分型。将选择的凝集素制成亲和层析柱

7、，将血清、糖蛋白或糖肽样品通过此柱，能被该凝集素识别的糖蛋白或糖肽就结合于柱上，不被结合的糖蛋白或糖肽组分就随洗脱缓冲液流出。然后用该凝集素特异结合的单糖或寡糖洗脱被结合的组分。人血清中糖蛋白的含量和种类比较多，其糖链结构的微小变化往往是预示某种疾病尤其是肿瘤的重要信息。研究表明，肿瘤患者血清中糖蛋白大都是N-糖链，且都发生了高甘露糖型糖链增多和岩藻糖基含量增加的变化12，15。伴刀豆球蛋白（Con A）可用于高甘露糖型糖蛋白的分离和富集，花生凝集素（PNA）可用于岩藻糖型糖蛋白的分离和富集，增加了样品纯化的特异性。制备的凝集素亲和层析柱也可多次使用，该方法经济实惠。与后续的凝胶电泳有很好的兼

8、容性，不需除去高丰度蛋白的预处理过程，减少了样品的损失。（4） 肝脏糖蛋白质组学在肿瘤标志物筛查中的作用随着人类肝脏蛋白质组计划的启动，肝脏糖蛋白质组学逐渐成为国内外的研究焦点。然而，由于现有的技术还很难进行糖链结构的测定和化学合成，故蛋白质糖链的结构和功能研究受到极大的限制。迄今为止，国内外尚未出现系统可靠的研究组织或细胞内蛋白质糖基化修饰的方法。2-DE与MS作为肝脏糖蛋白质组学的主流技术，两者结合已经成为糖蛋白结构解析的强大工具3，6。2-DE的第一向为等电聚焦电泳等电点信息，第二向为SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳。2-DE电泳后，用专门的图像扫描分析软件进行图像分析，对需研究的糖蛋白质点酶

9、解后经MS鉴定，应用比较生物信息学进行糖蛋白结构和功能的进一步鉴定和分析6。MALDI-TOF-MS方法在糖链的结构分析中得到了广泛应用，其优点是灵敏度高，其独特的软电离方式可以获得糖链完整的结构信息，结合源后裂解（PSD）可以分析得到糖链组成信息和肽指纹图谱（PMF），因此，该技术在确定糖链及其糖肽的分子量、糖链及肽链的顺序及连接位点等结构信息方面具有独特之处10，11，14。2-DE分离中以荧光显色为基础的糖蛋白染色技术的检测灵敏度可达到ng级甚至pg级，并且与下游的鉴定技术如MALDI-TOF-MS技术有很好的兼容性，因而在糖蛋白的分离与分析方面有很大的优势13，14。利用蛋白质组学的主

10、流技术2-DE与MS技术结合用于正常人血清和肝癌血清糖蛋白组成分差异的分析，该研究有助于了解肝癌血清中的糖蛋白表达变化情况，寻找肝癌新的特征糖蛋白，旨在为肝癌的早期血清学诊断及治疗药物靶点的筛选提供实验室参考依据，同时也尝试建立相对稳定、标准化的高通量糖蛋白质组学共性技术，推动后续的肝脏疾病比较糖蛋白质组学研究。综上所述，本课题组拟采用能与高甘露糖型的N-糖基化蛋白紧密结合的Con A和对岩藻糖型N-糖基化蛋白有特异性吸附作用的PNA富集正常人血清和肝癌血清中的高甘露糖型和高岩藻糖型糖蛋白，利用2-DE凝胶电泳对亲和产物进行分离，荧光染色，选取有特征性的糖蛋白，酶解后进行MALDI-TOF-M

11、S和生物信息学分析。通过比较正常人血清和肝癌血清糖蛋白表达谱的差异，从中选取具有代表性的糖蛋白，构建起高重复性的正常人血清和肝癌血清Con A 结合型糖蛋白和PNA结合型糖蛋白表达谱，搭建起研究糖基化蛋白的共性技术平台，最终建立起一套高通量、高重复性、高灵敏度的血清糖蛋白多肿瘤标志物联合诊断新方法，旨在为肝癌的早期诊断和发病机制的研究提供依据和信息，该研究在提高肝癌的早期诊断率方面具有重大价值。因此本研究还旨在建立起一套重复性好、高通量、高灵敏度的蛋白质糖基化研究新方法，搭建起一套可靠的从分离纯化到结构解析糖基化蛋白研究技术体系。参考文献：1. Hashem B. El-Serag*, Jor

12、ge A. Marrero, Lenhard Rudolph, K Rajender Reddy. Diagnosis and Treatment of Hepatocellular Carcinoma. GASTROENTEROLOGY, 2008, 134: 1752-1763.2. William S. Dalton1* and Stephen H. Friend*. Cancer Biomarkers-An Invitation to the Table Science, 2006, 312 （26）: 1165-1167.3. Anne Dell*, Howard R. Morris

13、. Glycoprotein Structure Determination by Mass Spectrometry, Science, 2001, 291 （23）: 2351-2355.4. Morten Thaysen-Andersen, Ida B. Thgersen, Ulrik Lademann, Hanne Offenberg, Anders M.B. Giessing, Jan J. Enghild, Hans Jrgen Nielsen, Nils Brnner, Peter Hjrup. Investigating the biomarker potential of g

14、lycoproteins using comparative glycoprofiling-application to tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Biochimica et Biophysica Acta, 2008, 1784: 455-463.5. Hiroyuki kaji, haruna saito, yoshio yamauchi, et al. Lectin affinity capture, isotope-codedtagging and mass spectrometry to identify N-linked g

15、lycoproteins. Nature biotechnology, 2003, 21 （6）: 667-669.6. Luca Quintana, Alberto Monasterio, Kepa Escuredo, Jokin del Amo, Pilar Alfonso, Felix Elortza, Simon Santa Cruz, Laureano Simn, Antonio Martnez, Pilar Giraldo, Miguel Pocov, Jos Luis Castrillo. Identification of chitotriosidase isoforms in

16、 plasma of Gaucher disease patients by two dimensional gel electrophoresis. Biochimica et Biophysica Acta, 2006, 1764: 1292-1298.7. Alex Monzo, Gunther K. Bonn, Andras Guttman. Lectin-immobilization strategies for affinity purification and separation of glycoconjugates. Trends in Analytical Chemistr

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18、nd linear discriminant analysis of N-glycans of human serum alpha-1-acid glycoprotein in cancer patients and healthy individuals. JOURNAL OF PROTEOMICS, 2008, 71: 186-197.10. Marjolein L.M Robijn, Joost Planken, Dieuwke Kornelis, Cornelis H. Hokke, Andr M. Deelder. Mass spectrometric detection of ur

19、inary oligosaccharides as markers of Schistosoma mansoni infection. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 2008, 102: 79-83.11. Jose L. Luque-Garcia, Thomas A. Neubert. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. Journ

20、al of Chromatography A, 2007, 1153: 259-276.12. Kazuhiro Tanabe*, Akihiro Deguchi, Mikito Higashi, Hisashi Usuki, Yasuyuki Suzuki, Youichi Uchimura, Shigeki Kuriyama, Kazuhiro Ikenaka. Outer arm fucosylation of N-glycans increases in sera of hepatocellular carcinoma patients. Biochemical and Biophys

21、ical Research Communications, 2008, 374: 219-225.13. Zhang Ying, Huang Linjuan, Wang Zhongfu. Techniques for Staining Glycoprotein on Gel Electrophoresis or Electroblotting. PROGRESS IN CHEMISTRY, 2008, 20: 1158-1163 14. ZHANG, Ying, HUANG, Lin-Juan, WANG, Zhong-Fu*. A Sensitive Derivatization Metho

22、d for the Determination of the Sugar Composition after Pre-column Reductive Amination with 3-Amino-9-ethylcarbazole （AEC） by High-performance Liquid Chromatography. Chinese Journal of Chemistry, 2007, 25: 1-10.15. Tamura A, O ita T, Sak izono K, et al. Clinical usefulness of lectin reactive fraction

23、 of alpha-fetoprotein in hepatocellular carcinoma. R insho Byo ri, 1998, 46: 1582. 项目的研究目标、研究内容、以及拟解决的关键科学问题2.1 研究目标本课题组拟采用Con A和PNA富集正常人血清和肝癌患者血清糖蛋白，利用蛋白质组学主流技术2-DE结合MS技术筛选和鉴定肝癌患者中异常表达的糖蛋白，以期发现新的特异性好、灵敏度高的血清肿瘤标志物。通过比较正常人血清和肝癌血清糖蛋白表达的差异，选取有代表性的糖蛋白点，建立正常人血清和肝癌血清Con A 结合型糖蛋白和PNA结合型糖蛋白表达谱，建立起一套高通量、高复性、

24、高灵敏性的血清糖蛋白多肿瘤标志物诊断新方法，为肝癌的早期诊断提供依据和信息，最终提高肝癌的早期诊断率，同时为肝癌发生、发展及信号转导新机制的研究提供理论依据，丰富该方面理论并为进一步发掘更为有效的肝癌治疗新靶点奠定理论及实验基础。2.2 研究内容2.2.1 标准糖蛋白分离方法的建立利用Con A特异吸附高甘露糖型糖蛋白的原理，选用富含N-糖链的高甘露糖型糖蛋白鸡蛋清白蛋白（Albumin）为标准糖蛋白对其进行分离纯化，并对分离条件进行优化。PNA采用相同方法进行研究。2.2.2 标准糖蛋白MALDI-TOF-MS鉴定方法的建立与完善MALDI-TOF-MS具有极高的灵敏度及准确度，由于其独有的

25、软电离方式，可用于数十万Da分子量的生物大分子的检测和分析，目前已被成功地用于糖蛋白的结构分析，与普通的化学方法相比，MS法快速、简单，结合网上数据库检索、凝集素亲和提取、2-DE以及靶上直接酶切等新方法，可以提供糖蛋白的一级结构乃至高级结构的信息。本课题组以标准糖蛋白为分析目标已建立了标准糖蛋白的MS鉴定方法，为后续样品的分析奠定了技术基础和基本保证。2.2.3 标准糖蛋白2-DE结合MALDI-TOF-MS分析方法的建立与完善近年来发展起来的二维凝胶电泳（two-dimentional gel electrophoresis, 2-DE）是一种大规模的蛋白质分离技术，能将数千种蛋白质同时分

26、离与展示。在分析蛋白质的翻译后修饰方面，可与MALDI-TOF-MS技术相配合，有广阔的应用前景。由于生物体内的糖蛋白含量很低，发展高灵敏度的特异性的糖蛋白胶上染色技术至关重要。本课题组拟选用以荧光显色为基础的染色试剂Pro-Q Emerald 300对糖蛋白进行染色，整个过程包括3个步骤：固定，氧化和染色，该反应基于PAS反应，条件温和，室温即可。同时还采用SYPRO Ruby染料对总蛋白染色，SYPRO Ruby染料的最大激发波长在610 nm（红色荧光），所有蛋白质被染成红色，而糖蛋白与Pro-Q Emerald 300共轭化合物的最大激发波长在530 nm（呈绿色），检测灵敏度可达到3

27、00 pg/条带的糖蛋白，利用计算机采集技术即可得到多种有关蛋白质的糖基化位点和表达程度的图谱，可在荧光灯下将非糖蛋白和糖蛋白区别切下，进行后续的MS鉴定。本课题组目前正在使用荧光标记物进行同类方法及产品的研制开发，以期发展一套高灵敏度和简便的具有自主知识产权的方法。 2.2.4 正常人血清和肝癌患者血清糖蛋白表达谱的建立和完善 收集正常人血清和肝癌血清两组，一组利用凝集素Con A分离纯化，一组利用凝集素PNA分离纯化，进行2-DE分离，利用基于PAS反应的荧光染料Pro-Q Emerald 300对糖蛋白染色结合SYPRO Ruby染料对总蛋白染色，染色完成后，图像分析正常人血清和肝癌血清

28、2-DE图谱寻找糖蛋白表达显著差异点，MALDI-TOF-MS技术对糖蛋白进行鉴定。通过2-DE结合MALDI-TOF-MS分析可以发现肝癌血清和正常人血清中糖蛋白表达谱质和量的变化，选取高重复性、有代表性差异点，建立高重复性的正常人及肝癌血清Con A结合型糖蛋白和PNA结合型糖蛋白表达谱。2.3 拟解决的关键学科问题1. 本研究完成后，有望建立高重复性的人正常人和肝癌血清Con A 结合型糖蛋白和PNA结合型糖蛋白表达谱，提高肝癌的早期诊断率。2. 目前还未有高通量的糖蛋白结构分析和合成的技术体系，通过对血清糖蛋白的分离纯化和鉴定，有望建立一套高通量、高复性、高灵敏性的血清糖蛋白分离和鉴定

29、技术，搭建起研究糖基化蛋白的共性技术平台。3. 通过比较肝癌血清和正常人血清中糖蛋白表达质和量的变化，有望揭示肝癌发生、发展及信号转导新机制，丰富该方面理论并为进一步发掘更为有效的肝癌治疗新靶点奠定理论及实验基础。3. 拟采用的研究方案及可行性分析技术路线图：3.1 研究方案：3.1.1 标准糖蛋白分离方法的建立利用Con A特异吸附高甘露糖型糖蛋白的原理，选用富含N-糖链的高甘露糖型标准糖蛋白Albumin为待分析样本对其进行分离纯化，并对分离条件进行优化。Con A色谱柱纯化方法操作如下：a. 用Washing buffer 冲洗Con A色谱柱至没有杂质和可溶性糖类物质；b. 1 mg样品缓慢注入色谱柱后，使样品与色谱柱充分吸附；c. Washing buffer 冲洗Con A色谱柱，洗出不保留组分；d. 加入含有甘露糖或甲基-甘露糖苷的Elution buffer，洗出高甘露糖型糖蛋白，收集；f. 脱盐，干燥，样品溶于100 l水中。PNA分离纯化糖蛋白路线与Con A基本相同。