重组质粒的构建转化与重组子筛选Word文档下载推荐.docx

1、当载体和外源DNA用同一种限制性核酸内切酶切割时，产生相同的黏性末端，连接后形成的重组DNA分子仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列。若外源DNA插入片段和适当的载体存在同源黏性末端，这将是最方便的克隆途径。但是，在同黏性末端连接方案中，存在高背景和两向插入的弊端。5、在基因工程中，转化的实现是借助于人工制备的感受态细胞。目前，常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法和RbCl（KCl）法。RbCl（KCl）法制备的感受态细胞转化效率高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验要求，制备的感受态细胞暂不用时，加入终浓度为15%的无菌甘油，-70可保存半年至一年。 经过CaCl2处理

2、的细胞细胞膜通透性增加，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热激或电穿孔技术，使载体分子进入受体细胞。进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择培养基上培养，即可筛选出重组子。影响感受态细胞制备及转化的因素：1）细胞的生长状态和密度：从甘油管中新鲜活化而不是多次转接的菌；培养至指数前期到指数期（OD6000.3-0.6）；应为限制-修饰系统缺陷菌株；受体细胞与所转化的载体性质应相匹配。2）质粒DNA的质量和浓度：超螺旋构象的质粒DNA，较其线性构象的转化率高10-100倍；加

3、入DNA的体积不应超过感受态细胞的5%，1ng的cccDNA即可使50L的感受态细胞达到饱和；对于同一类型的载体而言，分子量越大转化率越低。3）其他药品、试剂质量：如CaCl2应用高纯度药品、超纯水配制，过滤除菌、分装保存；所有试剂、容器、耗材等均需无菌处理；感受态细胞制备过程均需要无菌、冰浴操作。6、本实验以E.coli DH5菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后将pUC19质粒在42下热激90s，实现转化。质粒pUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒pUC19的受体细胞，在含有氨苄青霉素培养基上不生长。质粒pUC19进

4、入E.coli DH5后，通过-互补作用，形成完整的-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养基中的指示剂变红，转化子的菌落变成红色。当外源片段插入后失去-互补能力，因而不产生-半乳糖苷酶，不能利用培养基中的乳糖产生有机酸，而是利用培养基中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。挑取在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落，通过扩增培养，可将重组后的质粒提取出来，进行后续的酶切、连接等。7、重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，

5、同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子。本实验中采用的方法是平板筛选法和酶切验证。8、平板筛选法主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活，互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子。质粒pUC19携带有氨苄青霉素

6、抗性基因（Ampr ）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒pUC19的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。质粒pUC19进入E.coli DH 5后，通过-互补作用，形成完整的-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养基中的指示剂变红，转化子的菌落变红。不含质粒的E.coli DH 5，没有-半乳糖苷酶活性，不能利用培养基中的乳糖产生有机酸，而是利用培养基中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。重组后的载体DNA因为目的基因的插入位点在pUC19乳糖利用基因内部，不能形成-互

7、补作用，所以也不能利用培养基中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。9、利用互补现象对转化菌落进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌半乳糖苷酶的启动子及其肽链的DNA序列，此结构称为lacZ基因。LacZ基因编码的肽链是半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的半乳糖苷酶分子。LacZ基因编码的肽链与失去了正常氨基端的半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为互补。由互补而形成的有功能活性的半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷

8、）显色出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带着lacZ基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的半乳糖苷酶，在IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lacZ中的多克隆位点后，就会破坏肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的半乳糖苷酶相互补的活性肽，而导致不能形成有功能活性的半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。10、重组质粒是外源基因通过单酶切（或双酶切）与用相同的（或两种）限制性核酸内切酶

9、切割的质粒载体连接后获得的，因此在连接处仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列，用该酶（或两种酶）再次切割重组质粒，能把插入片段切离载体，根据琼脂糖凝胶电泳检测可见有载体片段和插入的外源DNA片段，并可知插入片段的大小。11、质粒不亲和性/不相容性（plasmid incompatibility）在没有选择压力的情况下，两种亲缘密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存的现象。不亲和质粒在细胞增殖过程中，两种亲缘关系密切的不同质粒中，必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉，这样的两种质粒为不亲和质粒。不亲和群（incompatibility group）具有亲缘关系，但彼此之间互不相容的一组质粒

10、。质粒不相容的分子基础：两种不亲和/相容质粒；同一个细胞中的两种不亲和质粒，随细胞分裂而分配到子细胞中；质粒扩增拷贝数增加；再分配中质粒比例发生改变；最终子细胞中只含一种质粒。【实验试剂与仪器】1、实验试剂：LB培养基，麦康凯培养基，抗生素（氨苄青霉素），1TAE电泳缓冲液，上样缓冲液（10loading buffer），琼脂糖，溴化乙锭（EB），ddH2O, 限制性核酸内切酶（Hind）及其相应的缓冲液,T4 DNA 连接酶，DNA，质粒pUC19，100mmol/L CaCl2溶液, 试剂盒（含有Rnase A的溶液，溶液，HB buffer，DNA washing buffer，elut

11、ion buffer）；Supercoiled DNA Ladder Marker, -Hind DNA Maker,pUC19 DNA Maker，DL2000 DNA Maker2、实验仪器：恒温振荡培养箱，高速离心机，漩涡振荡器，-20冰箱，Eppendorf管，不同型号枪头，微量移液器，培养皿，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，一次性手套，凝胶成像仪，酒精灯，恒温水浴锅，平板，试管，接种环，牙签3、菌株：E.coli DH5【操作步骤】一、 DNA和pUC19的单酶切1、在Eppendorf管中依次加入酶切反应各种成分：反应体系成分pUC19DNA（商品）体积/L

12、ddH2O14.070.010M Buffer2.010.0DNA3.015.0（0.3g/L）Hind （15U/L）1.05.0总计20.0100.02、各管样品混合均匀后，4000rpm，1min，将液体集中于管底；3、37反应1-2h，电泳检测酶切效率（1.2%琼脂糖，-20保存） 。二、 载体与外源DNA的连接反应1、在Eppendorf管中依次加入连接反应所需要的各种成分；连接反应成分加量/L3.5缓冲液pUC19/Hind 1.5 DNA/Hind T4 DNA 连接酶0.52、各管样品混匀后，4000rpm离心1min，将液体集中于管底；3、16恒温水浴锅过夜连接。三、 感受态

13、细胞的制备及质粒转化 A受体菌的培养 1、固-液接种：从LB平板中挑取新活化的E.coli DH5单菌落，接种于5mL LB培养基中，37振荡培养过夜； 2、液-液转接：以1%接种量将过夜培养的E.coli DH5接种于新鲜LB培养基中；37，220r/min振荡培养2-2.5h； 3、菌液冰浴：振荡培养2-2.5h后，将菌液冰浴。 B. 感受态细胞的制备 1、取2个无菌Ep管，各加入1.5mL菌液，4，4000rpm离心5min,弃上清。重复以上步骤至每个Ep管中收集3mL培养液的菌体； 2、残留液体涡旋细胞至混匀，加1mL预冷的100mmol/L CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置数分

14、钟。4，4000rpm离心5min，弃干净上清； 3、加入100L预冷的0.1M CaCl2，轻轻悬浮细胞，将其中一管分装至2管； 4、冰浴20min，感受态细胞制备完成。 C. 感受态细胞的转化 1、取新制备的感受态细胞悬液做转化实验： 实验转化组：感受态细胞悬液100L+5.0L连接产物 转化对照组：感受态细胞悬液50L+pUC19 1.0L 细胞对照组：感受态细胞悬液50L； 2、将以上样品轻轻混匀后冰浴10min； 4、向上述各管分别加入新鲜LB培养基900L（对照组加450L），摇匀，37振荡复苏0.5-1h，使受体菌恢复正常生长。 D. 稀释和涂布平板 1、将转化细胞溶液按一下操作

15、涂布平板：分别取50、100、150、200L培养液涂布在2个含有氨苄青霉素的麦康凯培养基平板上；取50L培养液涂布在一个含氨苄青霉素的麦康凯培养基平板上； 细胞对照组:取50L培养基分别涂布在含氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的麦康凯培养基平板上。 2、当菌液完全被培养基吸收后倒置平板，于37恒温培养箱中培养16-20h。四、重组子转化的筛选与验证 1、观察平板上有无菌落生长、菌落与平板颜色及菌落数量并记录； 2、从含有氨苄青霉素的麦康凯培养基平板上挑取8个不同的白色菌落划线于含氨苄青霉素的空平板上，37恒温培养16-20h；3、挑取平板上的白色菌落于20mL 含氨苄LB液体培养基中，37恒温振荡

16、培养过夜。五、重组质粒的提取（试剂盒法）与电泳检测 1、按E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Protocol试剂盒说明书提取高纯度质粒； 2、电泳检测：在离心管中加入2L ddH2O ,3L 质粒及1L 10Loading Buffer，混匀，快速离心，上样，120V，电泳30min。 3、EB染色10min,清水漂洗10min后，凝胶成像仪观察【实验结果及分析讨论】一、 pUC19酶切电泳检测 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 bp2313094166557436123222027564备注：1. -DNA/Hind DN

17、A Marker 上样量：5L 2. -DNA Marker 上样量：100ng 3. -DNA/Hind 上样量：5L4. pUC19 DNA Marker 上样量：100ng 5-6: sk1,sk2 pUC19/ Hind 上样量：10L7-14：sk5-sk12 pUC19/ Hind 上样量：15,16：Sk3 pUC19/ Hind （+，-） 上样量：10L 17,18：Sk4 pUC19/ Hind （+，-） 上样量：分析： 1、第10泳道为我组pUC19/ Hind 样品。可以看到有明显的两条亮带，对比pUC19 DNA Marker可知，下面一条亮带为还没有切开的超螺旋p

18、UC19质粒，上面一条亮带为切开的自提pUC19 质粒。 2、可以看到在50kb附近有弥散区域，应为没有除尽的染色质DNA。而最下方有一条暗带应为RNA杂质。 3、对比实验组-DNA/Hind与-DNA Marker，发现条带相同，表示-DNA 酶切完全，可以用于连接。二、 重组子筛选及酸碱理论检测1.重组子筛选结果实验设组培养基涂布量培养结果-实验组麦康凯培养基+氨苄青霉素50L2多数菌落为红色，少数为白色，大小中等；培养基为红色100L白色菌落多于红色菌落，大小中等，培养基为红色150L白色菌落稍多于红色菌落，为小型或中型菌落，出现粘连；200L菌落小且多，粘连程度高；-转化对照1菌落均为

19、红色；-细胞对照无菌落生长，培养基为红色麦康凯培养基菌落小且密集，菌落透明；培养基为黄色2.酸碱理论检测平板pH 值 图片DH5（pUC19）on MAC plate （Ap+,100g/mL）6.5 图2.酸碱理论检测图DH5on MAC plate （Ap-）7.2MAC plate （blank）5.5 3. DH5（Amp+）平板酸碱溶液检测滴加溶液现象图片3N HCl平板滴加部位变紫 图3.DH5（Amp+）平板酸碱溶液检测结果图3M NaAc, pH=5.2Solution, pH=4.8TE 溶液无明显颜色变化3N NaOH平板滴加部位变黄 分析： 1、在-实验组中，随着涂布量的

20、加大，菌落数目增加。在平板上均出现红色菌落和白色菌落。这是因为质粒pUC19进入E.coli DH 5后，通过-互补作用，形成完整的-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养基中的指示剂变红，含转化子的菌落变红； 2、在-转化对照组中，菌落为红色，平板也为红色，这是因为组中生长的菌落均为转入pUC19的E.coli DH 5，pUC19进入E.coli DH 5后，通过-互补作用，形成完整的-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养基中的指示剂变红，含转化子的菌落变红。且实验

21、结果说明在操作过程中以及系统中基本没有杂菌污染。 3、在-细胞对照组中，添加氨苄的麦康凯平板上无菌落生长，不添加氨苄的麦康凯平板上长有密集的透明菌落。这是因为DH5为氨苄敏感型菌株，不能在含氨苄青霉素的平板上生长。 4、仅不含pUC19的菌株培养基颜色变黄，其余均为红色，无变化。原因是：在麦康凯培养基平板上，转化子利用-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养基中的指示剂变红，故培养基颜色为红色；而不含pUC19质粒的菌株则会分解其他碳源，产生氨气，使培养基变成黄色。 5、同样基于-互补，蓝-白筛选与红-白筛选的原理不完全相同。两者均通过-互补作用，形成完整的-半乳糖苷酶。蓝-白

22、筛选是由于产生有色物质而使整个培养菌落产生颜色变化；而红-白筛选是由于产酸/碱，使培养基中的指示剂颜色变化，进而改变菌落颜色。 6、从酸碱理论检测的结果中可以看出DH5（pUC19）on MAC plate （Ap+,100g/mL） pH为6.5，DH5on MAC plate （Ap-） pH为7.2，而MAC plate （blank） pH为5.5。这说明不含pUC19质粒的菌株代谢使得培养基变碱，而DH5（pUC19）on MAC plate （Ap+,100g/mL）实验组平板上由于含pUC19质粒的菌株代谢分解乳糖产生有机酸，但是同时含有重组质粒的菌株不能分解乳糖，代谢产生氨气，

23、二者共同作用导致平板pH略有上升。实验结果符合酸碱理论。 7、从DH5（Amp+）平板酸碱溶液检测结果可已看出，加酸后培养基颜色变紫，加碱后培养基颜色变黄，加TE溶液无明显颜色变化。这是因为麦康凯培养基中添加了中性红指示剂，中性红变色范围为6.4-8.0。说明DH5（Amp+）平板本身为偏碱性，添加酸性溶液后变紫，添加酸性溶液后变黄，符合酸碱理论。三、重组质粒电泳检测1164910085 8023 6133 5026 3049 2087 图4.重组质粒电泳检测结果图 备注： 1Supercoiled DNA Ladder Marker 上样量：6L2.pUC19 DNA Marker 上样量：

24、100ng3-4. sk7重组质粒R1，R2 上样量：3L 5-6Sk8重组质粒R1，R2 上样量：7-8. sk9重组质粒R1，R2 上样量：9-10. sk10重组质粒R1，R2 上样量：11-12. sk11重组质粒R1，R2 上样量：13-14. sk12重组质粒R1，R2 上样量：15-16:空17：pUC19 DNA Marker 上样量：18. -DNA/Hind DNA Marker 上样量： 第5泳道样品为我组重组质粒R1，对比超螺旋marker，质粒大小约为10000bp，pUC19质粒大小为2.7kb，可知插入片段大小约为6500bp左右。第6泳道样品为我组重组之力R2，

25、对比超螺旋marker，质粒大小约为6000bp，可判断插入片段大小约为2kb。此时插入片段的大小只能粗略估计，具体大小需根据后续PCR及酶切检测判断。【附录】培养基及试剂配方1、LB液体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%NaCl。用NaOH调pH至7.2以上，121灭菌20min备用。2、麦康凯培养基：取52g麦康凯培养基加入1000mL去离子水，溶解后121高温灭菌20min。冷却至60左右加入氨苄青霉素贮存液至终浓度100g/mL,混匀后倾注平板。3、氨苄青霉素：母液浓度为100mg/mL，工作浓度为50-100g/mL。4、10TAE缓冲液：母液50TAE缓冲液（Tris碱242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/L EDTA（pH8.0）100mL，定容至1L）稀释20倍。5、溴化乙锭（EB）染色液：1000母液浓度0.5mg/mL，工作浓度0.5mg/L水溶液。10、上样缓冲液（6）：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液。