菌物代谢组学研究的方法与内容.docx

1、菌物代谢组学研究的方法与内容菌物代谢组学研究的方法与内容 摘要：代谢组学是一个可灵敏地捕捉各种生物或非生物因素导致的供试样本中小分子代谢成分变化及其规律的实验方法，被广泛应用于生理生化、病理药理、生物工程、化学生态等很多方面。但在菌物研究方面，由于种群数量庞大、未知结构次生代谢产物众多，严重影响到生物标记物的鉴定和进一步深入分析。为此，作者在总结目前菌物代谢组研究成果的基础上，结合十年的菌物代谢组学研究经验，提出如果要提高菌物代谢组学研究水平，就必须要加快菌物代谢物数据库以及基因组数据库的建设，同时，选择合理的代谢组学方法和多组学多方法联合分析也是现阶段提升菌物代谢组学研究水平的最可行的办法之

2、一。 关键词：代谢组学; 菌物; 进展; 问题; Abstract：Metabolomics is an experimental method which can sensitively capture the small molecular changes and regularity in testing samples caused by various biotic or abiotic factors. It is widely used in physiology, biochemistry, pathology, pharmacology, bioengineering, ch

3、emical ecology and many other fields. Fungi have a large population size and contain large number of unknown secondary metabolites which severely limited identification and further analysis of the biomarkers. Therefore, based on summarizing metabolomics literaturesof fungi and ten years experience i

4、n fungal metabolomics research, the author suggest that it is necessary to speed up the construction of the database of metabolites and genome database of fungi to improve the level of metabolomics research. Meanwhile, rational selection of metabolomics methods and using combined omics is also one o

5、f the most feasible ways to improve the level of metabolomics research at present. Keyword：metabolonics; fungi; advances; problems; 代谢组学（metabolomics 或 metabonomics）概念虽然是上世纪末和本世纪初才由Fiehn和Nicholson分别提出，但其随后发展十分迅猛。据PubMed网站统计，到2020年7月30日，全世界发表有关metabolomics的文章已达42350篇，其中与真菌有关的论文5642篇。 代谢组学研究的对象是代谢组（me

6、tabolome），即生物样本中所有小分子代谢物的集合。相对于基因组、转录组和蛋白组而言，代谢组是处于生命活动的最下游，大部分小分子代谢物都是多步酶促反应的结果，因此除遗传因素外，任何环境的扰动和时空的变化都可能导致代谢组的变化，同时，这些代谢物的变化反过来又会影响到生物的基因表达、生长分化、功能和行为。正因如此，代谢组学研究已成洞察疾病发生发展过程，了解药物代谢机理，探索生命活动奥秘的最灵敏的武器之一。在过去20年中，代谢组学的理论、技术和应用都得到了极大的发展，特别是在医药领域得到广泛的应用，并取得丰硕成果。相对于在医药领域的广泛应用，代谢组学在菌物研究中的应用较少，其发表的文章仅占代谢组

7、相关文章总数的13.3%。虽然全球已知真菌数量超过十万种，未知真菌估计有数百万种，但目前仅少数种有过代谢组学研究，其中有关酵母的研究报道占菌物代谢组学研究的19.8%。实际上metabolome（代谢组）的概念最早就是Oliver在研究酵母代谢时提出的。相比较而言，人们对人类自身及常见药用植物的小分子代谢物了解较多，而除酵母等少数真菌以外，人们对大量已知或未知菌物的代谢知之甚少，同时，菌物的次生代谢产物种类远较动物和常见植物的多，且更加复杂多样，这是因为菌物能通过改变自身的代谢来适应各种环境，参与物种间竞争和交流。由于菌物的种类的多样性和代谢的复杂性，以及相关研究基础不足，使得目前菌物代谢组研

8、究仍有许多问题。本文将结合本课题组十余年的菌物代谢组学研究经验，对菌物代谢组的研究进展和存在的问题进行总结和讨论。 1、菌物代谢组学研究的方法选择 代谢组学研究的方法主要有基于核磁共振（NMR）、基于气相色谱质谱联用（GC-MS）或基于高效液相色谱质谱联用（HPLC-MS）的非靶标代谢组学分析（Untargeted metabolomics）、靶标代谢组学分析（Targeted metabolomics）或广泛靶标代谢组学分析（Widely targeted metabolomics）等。这些代谢组学方法在菌物代谢组研究中都有应用，但目前应用最多的是基于液质联用的非靶标代谢组学分析。 1.1、

9、 基于核磁共振的代谢组学分析 在代谢组学发展初期，基于液体核磁共振氢谱（1H NMR）的代谢组学分析应用较多。该方法具有样品处理较简单，不损耗样品，重复性好等优点，但也存在很多问题，如灵敏度低，需要昂贵的氘代试剂提取样品，仪器费用高，很难对样品中浓度相差较大的成分实现同时检测，对复杂样品检测的准确度不高，当然，这些确点也在不断改进和完善中，如用二维核磁改善一维核磁中大量信号重叠问题，用固体核磁做到活体内检测等。目前在医学领域基于核磁共振氢谱的代谢组学方法仍有较多应用，因为动物小分子代谢物相对简单，同时其组成和结构都已有较为透彻的研究，因此可以仅凭混合物氢谱就可完成大部分差异物的初步定性和定量分

10、析。至于二维核磁及固体核磁目前应用尚难以普及，前者耗时较多，后者分辨率远低于液体核磁，可得到的代谢物信息太少。 在菌物研究中，基于液体核磁共振氢谱（1H）、碳谱（13C）、二维谱（2D）的代谢组学分析，以及氢谱代谢组与转录组（Transcriptomics）联合分析都有不少报道，如Zhang 等用基于液体核磁共振氢谱的代谢组学方法比较了野生和人工培养的冬虫夏草代谢组差异，共鉴定了糖类、氨基酸和核苷等56个差异标记物；Puig-Castellví等利用基于一维氢谱（1H）和二维碳氢直接相关谱（1H-13C HSQC）的代谢组学分析，在不同培养的酵母中检测到超过50个差异代谢物。但是

11、，与基于液质联用的代谢组学分析相比，基于核磁共振的代谢组学分析，其鉴定的化合物普遍偏少，一般最多数十个，而我们在基于液质联用的代谢组学分析时，少则可鉴定数十个差异代谢物，多则超过100个，显然，在代谢物复杂的菌物代谢组研究中，基于核磁共振的方法没有明显优势。当然，如果仅对菌物中特定类群的少数已知物质进行靶标代谢组学（Targeted metabolomics）研究，此时基于核磁共振的代谢组学方法也是可以胜任的。 基于固体核磁的代谢组学分析在菌物研究中应用较少，目前仅见Reichhardt等用固体核磁对烟曲霉生物膜的孢外基质进行了类似于代谢谱（metabolite profiling）的分析，虽

12、然他们尝试了固体核磁碳谱（13C）、氮谱（15N）和磷谱（31P）分析，但能得到的代谢物结构信息非常少，仅能初步判断含羰基化合物、芳香化合物和糖类等有限信息，显然，该方法在菌物小分子代谢物研究中劣势非常明显，这是因为核磁共振碳谱、氮谱和磷谱的灵敏度都非常低，同时固体核磁的灵敏度和分辨率又远低于液体核磁，而液体核磁的灵敏度和分辨率又远低于液质联用。 1.2、 基于气质联用的代谢组学分析 基于气质联用的代谢组学方法，包括基于GC-MS或GC-MS/MS的非靶标及靶标代谢组学方法是一技术非常成熟的代谢组学方法，是早期代谢组学研究的主要方法之一，因为早期的液质联用特别是高分辨HPLC-MS以及HPLC

13、-MS/MS等方法还未普及，而当时GC-MS技术已较成熟，有较完善的基于电子轰击离子化的化合物质谱库如NIST数据库等，特别适合挥发性成分及糖类、氨基酸和酯类等常见小分子代谢物的组学分析。近年该方法应用有减少趋势，这是因为除天然挥发性成分分析外，非挥发性样品都需要衍生化处理，如烷基化、甲酯化、酰化和卤化等，样品处理较复杂，并且各种衍生化方法仅能对特定类型化合物进行衍生化，同时，检测的分子量范围有限，数据库的化合物以常见的低分子量化合物为主，对菌物等复杂样品分析的优势较小。 对于菌物中挥发性代谢物的组学分析而言，基于气质联用的代谢组学方法无疑仍是最佳选择。脂类等低极性代谢物在常见的电喷雾离子源（

14、ESI）液质联用仪上离子化较差，而衍生化后采用基于气质联用的代谢组学方法却能取得较好的分析效果。另外，气质联用仪价格较低，应用较普及，对常见低分子量成分分析效果较好。正因如此，目前基于气质联用的非靶标分析及靶标分析在菌物研究中仍有一定的应用，如用基于气质联用的靶标代谢组学方法研究病原真菌的Sphingolipidomics （鞘酯代谢组学） ；用非靶标方法（GC-MS untargeted metabolomics）研究植物病原真菌对葡萄的化学成分影响；用非靶标方法研究铁皮石斛与胶孢炭疽菌互作机制等等。但是，纵观上述研究报道可以发现，基于气质联用的代谢组分析，其鉴定的分子普遍偏小，主要是结构简

15、单的小分子有机酸、醇类、糖类、氨基酸、核苷和碱基等常见代谢物，真菌特征代谢物较少，显然，该方法对菌物样本的代谢组分析并不全面，最好将气质联用和液质联用联合起来进行代谢组分析，这样便可更全面地完成代谢组分析，如Azzollini等用基于GC-MS和HPLC-MS的非靶标代谢组学方法，成功地研究了代谢复杂的混合培养真菌的代谢组变化。 1.3、基于液质联用的代谢组学分析 自代谢组学概念提出以来，基于液质联用的代谢组学方法发展最快，目前已呈一家独大的趋势，这得益于液质联用仪器的进步和应用的普及，以及相关新技术新方法的开发。目前液质联用仪的质谱分辨率已由当初的数千增加到超过十万，可以得到十分精确的质荷比

16、，大大增加了代谢物鉴定的准确性。目前高分辨质谱如飞行时间质谱（TOF）、离子轨道阱质谱（Orbitrap）和傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR）在液质联用中应用越来越普遍。三重四级杆质谱（QQQ）、四级杆与飞行时间串联质谱（QTOF）、四级杆与离子轨道阱串联质谱等仪器分析还能同时得到分子离子和碎片离子信息，使代谢物的鉴定更加准确。除高分辨质谱外，液质联用的二级阵列检测器还能得到代谢物的紫外光谱，使化合物鉴定的准确性进一步提高。液质联用分析的另一大优势是高效液相色谱柱对代谢物中混合物的分离。色谱柱对进入质谱的代谢物进行预先分离，极大地减化了混合物中单个化合物的质谱区分，也减少了离子化及质谱过程中化合物或离子的相互干扰，提高了代谢物的分析容量和准确性，使得一次进样可实现数十个甚至数百个化合物的分离和初步鉴定。正因如此，基于液质联用的代谢组学分析方法特别适合真菌等复杂样品的代谢组分析。目前已有大量基于液质联用的菌物代谢组学研