液相色谱溶剂系统与优化天施康内部培训教材Word文档下载推荐.docx

1、其中，n为色谱柱的理论塔板数；为相对保留值或分配系数比（K2/K1）；k2为相邻两组分中保留时间长的组分的容量因子。a项取决于柱效，柱效高（n大），a项大。b与c项相关联，而且都与色谱柱及流动相的性质有关，但b主要取决于流动相的种类（极性），在流动相的种类）（包括元数）选定后，调整流动相的配比，可改变洗脱能力，进而改变c项。选择实验条件，首要任务是使1，即b0。只有在1的前提下，增加柱效n，适当增加k2，才能增加分离度R。 6、速率理论及范第姆特方程（略） 7、超高压液相色谱（UPLC）：采用1.7m粒径的填料，内径1.0cm及2.1cm，柱长510cm，柱效为一般高效液相色谱柱的3倍以上。参

2、见2010版中国药典一部丹参滴丸项下的指纹图谱。第二小节 液相色谱溶剂系统正确选择溶剂组成溶剂系统及合适的配比，需要熟悉各色谱法的分离机制和溶剂的分类。一、液-固吸附色谱流动相为液体，固定相是固体吸附剂的色谱法，称为液-固吸附色谱。 常用吸附剂硅胶、氧化铝。如工作中最常用到的硅胶（薄层）色谱、氧化铝柱等。注意：少数以硅胶薄层色谱方法并非吸附色谱！请举例 1、分离机制：被分离的组分（溶质分子）与流动相争夺吸附剂表面的活性中心，靠溶质分子吸的吸附系数的差别而分离。其中，S是色谱柱中吸附剂的表面积；Vm是流动相在色谱柱中占有的体积；K是吸附平衡常数。因为容量因子k=KS/Vm,所以在吸附色谱法中，选

3、择实验条件务使组分间的容量因子k产生差别，以达到分离的目的。请问：硅胶吸附色谱表面的活性中心是什么？ 2、固定相（硅胶）与溶质的亲和力硅胶与溶质分子的亲和力顺序（容量因子顺序）：饱和烃芳烃有机卤化物硫醚醚硝基化合物酯醛酮醇胺砜亚砜酰胺羧酸。与硅胶亲和力大的溶质，容量因子k大，保留时间长，晚出柱（薄层色谱中Rf值小）。 3、流动相的洗脱能力液-固色谱法流动相的洗脱能力与溶剂强度参数和介电常数等有关，选择性主要取决于溶剂的分子间的类型（溶剂分类的组别）。常用Snyder溶剂强度参数（单位吸附剂表面的吸附能）来定量地描述流动相的洗脱能力。定义式如下：式中，E为吸附能；A为吸附剂的表面积。溶剂强度参数

4、值是溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能。值越大，固定相对溶剂的吸附能力越强，即溶剂的洗脱能力越强，则溶质的k值越小。溶剂溶剂强度己烷0.00乙酸乙酯0.38异辛烷0.01二噁烷0.49四氯化碳0.11乙腈0.50四氯丙烷0.22异丙醇0.63氯仿0.26甲醇0.73二氯甲烷0.32水20.73四氢呋喃0.35乙酸乙醚上表列出了以硅胶为吸附剂时的一些纯溶剂的值。当某溶质在某硅胶柱（或硅胶薄层板）上进行分离时，如果选用的初始溶剂太强使得样品组分的k值过小，那么就要从表中选择值较小的溶剂来代替；反之，如果初选溶剂的值太小而使样品组分的k值过大，则应选用较大的溶剂。这样，通过尝试就可以找到强度合适

5、的溶剂为流动相。二元流动相：两种纯溶剂适当配比浓度可以产生适当的洗脱强度（以容量因子1k10，k=35为最佳）；寻找等洗脱强度不同溶剂组成的二元溶剂系统，以提高选择性，因组成不同，分配系数比不同，选择性不同。 4、流动相的选择性选择性（分配系数比）不仅决定于，而且还受诸如试样分子与溶剂分子间的氢键作用等二次效应的影响。预测值随着溶剂成分变化时的经验规律强溶剂很大或者很小时都会得到最大的值；含醇的溶剂系统常常会得到与其他溶剂系统不同的值，因为样品和溶剂间的氢键作用会使有很大的变化！含有强碱性或非碱性强溶剂组分的溶剂系统可得到最大的值。二、液-液分配正相色谱和正相键合相色谱主要用于分离极性、中等极

6、性和弱极性分子。 1、液-液分配正相色谱色谱：采用含少量水（含水量17%）的失活硅胶做固定相。流动相选择规律与吸附色谱完全（？）一致。 2、正相键合相色谱：如氰基键合相、氨基键合相。选择分离条件时，务使样品的各组分在固定相与流动相中的溶解度产生差别，即使K或k产生差别，才能分离。正相色谱法溶剂系统的洗脱能力用溶剂的极性参数（P）值表示。P组别正己烷4.1异丙醚2.44.42.85.13.1丙酮正丙醇4.05.86.010.2值大，极性大，洗脱能力大。多元溶剂系统：洗脱能力也用极性参数P表示（极性参数具有加和性）；选择性则由构成流动相的各纯溶剂的性质（类别）左右。Snyder溶剂分类：根据溶质与

7、溶剂分子间作用力不同将常用溶剂分为8组。与组溶剂为质子受体溶剂；组溶剂为偶极作用力溶剂；为质子给予体溶剂，其他组的溶剂的性质介于其间，作用力类型不典型。不同组别的溶剂虽然洗脱能力可能相同，但选择性不同。例如甲醇和丙酮的P都是5.1，极性相同，但组别不同，选择性不同。用甲醇分别不开的物质对，改用丙酮后，有可能分开，反之亦然。三、反相（键合相）色谱法的分离机制与流动相疏溶剂理论。 2、流动相反相色谱法的流动相的极性大于固定相，通常是用甲醇、乙腈或四氢呋喃等极性溶剂与底剂水组成二元或多元流动相。溶剂强度因数（S）：流动相的洗脱能力用溶剂强度因数（S）衡量。S值3.53.0乙醇3.63.24.24.5

8、多元流动相的强度因数Sab值计算公式：式中，Sa与Sb分别为纯溶剂a与b的溶剂强度因数；a和b分别为纯溶剂a与b的体积分数。该公式可以计算多元溶剂系统的强度因数，而且可以计算等洗脱强度的替代溶剂组成。 3、反相流动相的选择（1）二元流动相：一般以洗脱力最弱的水（组）做为基础溶剂（底剂），再加入一定量的可与水互溶的有机极性调节剂构成，常用的首选极性调节剂为甲醇（组）与乙腈（组）。按洗脱能力的要求（重点组分的k=25）。组成最常用的甲醇-水或乙腈-水洗脱剂。（2）多元流动相组成：若二元流动相不能满足需要，可配置多元流动相。多元流动相的构成参考原则：在二元流动相中加入少量的四氢呋喃（组），常能改善某

9、些难分离的物质对的分离度；若某些色谱峰拖尾，可加减尾剂。一般常用的减尾剂为有机碱类，如三乙胺等。其减尾的作用，主要是有机碱与硅胶的酸性硅羟基作用，降低了硅羟基的吸附作用。用水、甲醇、乙腈、四氢呋喃，按四面体法组成三元或四元溶剂系统，并进行优化，选出最佳溶剂系统。分离弱有机酸或弱有机碱，可用离子抑制色谱法。示例：确定等洗脱剂的替代溶剂系统用OSD柱分离苯、萘、联苯、蒽及芘等芳烃类混合物，可用甲醇-水（80:20）为流动相，分离效果较好。欲改为等洗脱能力的乙腈-水为流动相，请问该溶剂系统的配比应是多少？甲醇-水（80:20）的S=3.00.80+0.00.20=2.4等洗脱能力的乙腈-水的S，也应

10、该是2.4，因此，2.4=3.4乙腈。则乙腈=0.718，得等洗脱能力的替代溶剂系统为乙腈-水（71.8:28.2）。离子抑制色谱法：在反相色谱法中，通过调节流动相的pH，抑制样品组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法（ion suppression chromatography, ISC）。需要注意的是，色谱柱有pH适用范围。pH8可能使载体硅胶溶解；pH2可能使键合相的键合基团脱落。 1、紫外截止波长高效液相色谱仪应用最多的检测器是紫外检测器，用于检测有紫外吸收的样品（具有-或p-共轭结构的化合物）。使用紫外检测器的时应考虑截止波长

11、。紫外截止波长的定义：“到达检测器时的透射光强被削弱到10%的入射光强（以空气为参照，吸光度A=1）时，对应的波长就称为紫外截止波长”。溶 剂截止波长范围/nm190正己烷、环己烷190205脂肪醇（甲醇、异丙醇）205220脂肪醚（二乙醚等）210220氯代烷烃（二氯甲烷、氯仿）220270乙酸酯（乙酸乙酯）225245苯、烷基取代苯（甲苯、二甲苯）270290脂肪酮（丙酮）320340 2、黏度溶剂的黏度对色谱分析的影响，表现为溶剂在色谱系统中对被压缩产生的抵抗力。其中，P 是溶剂对柱长L柱上的压力差，是柱内半径，F是流动相的流速dp是粒度直径，是流动相的黏度。压力差正比于溶剂的黏度、柱长

12、和流速，反比于粒度直径的平方。高黏度溶剂的使用会引起填料的迅速损坏，明显降低色谱柱的寿命，增大色谱系统的维持费用。3、混溶性和溶解度混溶性：两种化合物如果能以任意比例相混而不出现两个不相溶的相；溶解性：一种化合物以一定量在另一种溶剂中能溶解，在一定量溶剂B中，能溶解最大量的溶质A就称为A在B中的溶解度。例如，二氯甲烷和水是互不相溶的，因此它们具有不相混溶性，但是水中可以溶解1.6%的二氯甲烷，而二氯甲烷中能够溶解0.2%的水。溶解性受温度影响很大。因此当使用的溶剂组成接近溶解饱和度时，就必须关注其是否可能会发生沉淀。另外，溶解时会显著放热（例如醇与水混合）或者吸热（例如乙腈与醇混合），混合后的

13、体积会缩小或者增大。4、缓冲剂及其他添加剂：用量及浓度（结晶析出的问题）5、挥发性：流动相脱气时应注意。6、不同溶剂的注意事项水：纯化水的要求；醚：四氢呋喃等，容易形成过氧化物；醇类和酮类：截止波长高含氯烷烃：氯仿、二氯甲烷等，见光降解，通常此试剂中加稳定剂；7、样品溶液溶解样品的溶剂应采用流动相，可避免系统峰的干扰。溶剂峰和溶剂效应一、薄层色谱法的基本理论和概念1、基本概念和理论比移值（Rf）分离度与分离数塔板数与斑点宽度斑点压缩效应展开方式（上行、下行、直线、圆形等等）；洗脱规律：一般认为吸附色谱的原理是竞争吸附。样品的极性越大，越容易被吸附因而Rf越小；而流动相的极性越大，洗脱能力越强因

14、而Rf越大。小常识：展开距离的平方与所需时间成正比，展开距离加倍则消耗4倍时间。2、直线展开中Rf值与k值（容量因子）的对应关系k0.5123456789Rf0.670.330.250.200.170.140.120.10上表数值显示，k值小于4的物质，占有薄层板80%的空间；而k值大于4的物质，仅占据薄层板的20%的空间。由此可知，薄层色谱适于分离k值小于4（或Rf大于0.2）的物质而不适合分离k值大的物质。k值小于4的有被薄层分离开的可能，而k值大的物质因为展开空间不够，被薄层分开的可能性很小。二、气固平衡和液固平衡 1、气固平衡气固平衡是平面色谱的特殊情况，对平面色谱过程有很大影响。例证

15、：用乙酸乙酯分别在甲板（未经饱和的薄层板）和乙板（事先用乙酸乙酯饱和15min）上展开苏丹-，结果在甲板上的苏丹-其Rf等于1而乙板上的苏丹-其Rf仅为0.65。此例说明：由于预饱和，使本来应该出现在流动相前沿的样品出现在Rf=0.65，说明真正的前沿（由毛细作用进入薄层板的流动相所抵达的位置）的确在Rf=0.65位置，而前面的流动相是预先吸附在薄层板上（肉眼当时看不出来）而被后来进入薄层板的流动相“挤”到了前面才显出了肉眼可察觉的状态。多元混合流动相的气固平衡比较复杂，固定相既优先吸附极性大的气体（蒸汽压往往偏低）的倾向；又有优先吸附蒸汽压大的气体（极性往往偏低）的倾向，故不好预测。 2、液

16、固平衡液固平衡的影像主要表现在多元混合流动相上。固定相优先吸附极性大的溶剂，会导致流动相组成的改变，而流动相组成的改变有可能使本来互溶的流动相在板上分层，形成多个前沿。当然，流动相组成的改变也使展开过程包含有梯度展开过程，这往往有对分离有利。另一方面，板上液相组成的改变也会反过来影响气液平衡，从而又影响气固平衡；大气中的水分也会被薄层板吸附，这既要影响薄层板的性质，也会影响到气液和固液平衡；所有这些都难用数学语言精确描述，但又对薄层色谱过程有重大影响！三、薄层色谱的操作技术 1、活化活化与否根据具体情况决定。北方气候干燥，自然阴干与活化后的薄层板差异不大，一般可不活化；但如对重现性有较高要求，

17、希望将所有条件严格固定，可考虑活化。活化后的薄层板在空气中暴露3min（相对湿度50%情况下），会丧失原有活性的一半；暴露15min，吸附的水分已达最大值。因此最关键也是最困难的步骤是如何控制环境的湿度。此外，点样等操作时间也要尽可能短或严格控制。否则，活化就失去了意义。 2、饱和是否需要饱和，存在争议。饱和的主要目的是消除边缘效应。饱和的好处是：Rf值的重现性较好；饱和的缺点是：分离效果可能略逊于不饱和室，因为不饱和室的有效展开距离较长；其次是挥发可能导致薄层板上的流动相组成有微妙的变化，产生类似梯度展开的效果。另：实际操作中我们常常讲的“饱和XX分钟”分两个层面：a.将展开剂倒入层析缸中，

18、密闭。此时，展开剂挥发，展开剂蒸汽在展开室内到达饱和，此饱和可称之为“室饱和”。如果未达到“室饱和”即开始展开，则展开过程中薄层板上的展开剂挥发到展开室中，将会影响薄层板上的溶剂组成；b.将薄层板放入置有展开剂的层析缸中，但未浸入展开剂中。此时，展开室内的蒸汽被薄层板吸附，当蒸汽分子在薄层板上“吸附-解吸附”达到平衡时，此时饱和可称之为“板饱和”。室饱和和板饱和的过程可以同时进行。另外由此可见，展开剂用量不能过小。 3、点样量点样的斑点宽度：在薄层板不超载的情况下，实际点样宽度是多少，最终斑点宽度就增加多少；斑点宽度受点样宽度的影像，但影像不大。点样量：点样量越少越好。但实际过程中，应根据鉴定

19、限决定点样量。点样量过小无法观察到，点样量过大则会过载。条带状点样的方式，可以适当提高点样量同时保证点样量不过载。四、薄层色谱法的流动相在薄层色谱法中，固定相选择的余地很小，流动相的种类很多，分离的好坏主要由流动相决定。因此，掌握流动相的分类和选择性原则很重要。 1、溶剂的分类可用于薄层色谱法的溶剂有几十种，合理的分类有，利于选择。（1）Snyder分组Snyder选择乙醇（质子给予体）、二氧六环（质子接受体）、硝基甲烷（偶极分子）作参考物质，测定了81种常用溶剂与这三种物质的相对亲和力，分别用Xe、Xd、Xn表示（Xe+Xd+Xn=1）。以Xe、Xd、Xn为顶点在三角形坐标图上将81种溶剂分

20、成8组。溶剂类型代表性溶剂脂肪醚异丙醚、甲基叔丁基醚脂肪醇甲醇、乙醇吡啶及其衍生物，酰胺，亚砜二醇、苄醇、乙酸、甲酰胺乙酸、二甲基甲酰胺二氯甲烷、二氯乙烷脂肪酮、酯、砜、腈乙腈、丙酮、二氧六环芳烃、卤代芳烃、硝基化合物芳醚笨、甲苯、硝基甲烷氟代醇、间甲酚、水、氯仿组溶剂Xe值较大，属于质子受体溶剂，以脂肪醚为代表；组Xd相对较大，属于质子给予体溶剂，以氯仿为代表；组Xn相对最大，属于偶极作用力溶剂，以二氯甲烷为代表；组溶剂为脂肪醇类，按分类为质子受体溶剂，以甲醇为代表。同样是卤代甲烷，为什么氯仿是质子给予体溶剂，而二氯甲烷却是偶极作用力溶剂？诱导力 色散力 取向力（2）模糊聚类溶剂分组张敬宝在

21、Snyder实验数据基础上改进了分组。说 明乙腈、硝基乙烷电子接受体氯苯、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲苯电子给予体甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇质子给予体冰醋酸、水、甲酸、氯仿强质子给予体乙醚、三乙胺质子接受体大偶极矩环己烷、正己烷、四氯化碳2、流动相选择的原则和方法 （1）预实验：微量圆环法、小型色谱法 （2）选择原则通常选择二元以上的流动相系统，便于调节极性。混合展开剂中，比例较大的主要溶剂起到溶解物质和基本分离的作用，通常极性较低。极性较大的溶剂用于调节Rf值，中等极性的溶剂往往起到助溶作用，或降低流动相的黏度。初试的目的是使斑点群 落在薄层色谱适宜的展开区间（Rf0.2）。在此基础上再考虑

22、相邻斑点的分离问题。一般认为：改变流动相中的溶剂比例，主要改变被测物质的k值，从而改变被测物质的Rf值；而改变流动相中的溶剂种类，主要改变分配系数的比值，有可能改变相邻物质的分离度。问题是：一旦改变流动相的种类，又会重新面临使斑点群落在薄层色谱适宜展开区间的问题。这是一个不断尝试和调整的过程。当需要更换流动相中的溶剂时，不要再在同一类种选择，而应该在其他溶剂中选择。因为同一种类的流动相，其作用力基本相同，更换后产生明显效果的可能性不大。而不同种类的流动相，其作用力不相同，更换后有可能造成差异，改善分离。如果斑点有比较长的拖尾，有可能使弱酸、弱碱或其盐类的解离造成的（也可能是样品量太大）。因解离

23、的部分机型强滞后，未解离大部分前移后因化学平衡原理继续解离，周而复始，会造成极宽的条带状斑点。加入一些酸、碱可起到抑制作用。对于强极性流动相仍不能对推动的斑点，可考虑换碱性氧化铝固定相。薄层色谱的特点是塔板数少，因此，各种溶剂优化方法所能挖掘的潜力也有限，如果方法比较复杂，就不如按上述原则粗试合算；由于同一原因，指望在一块薄层板上用一套溶剂系统分离开复杂混合物也不现实，改换分离方式，往往是明智的选择。本节重点以高效液相色谱法为例，讲述用于溶剂系统组成选择的三角形法。1、溶剂的洗脱参数溶剂对溶质洗脱能力的评价方法。第二节已经介绍了溶剂强度参数（基于色谱的吸附平衡），溶剂的极性参数（P）（基于色谱

24、的分配平衡），溶剂强度因数（S）（用于反相洗脱）。洗脱参数具有加和性。2、确定适宜的洗脱强度通过调节混合溶剂的配比可连续改变溶剂的洗脱强度，从而改变样品组分的容量因子。例如，欲确定分离某混合物的适宜洗脱强度，可以采用乙腈-水二元溶剂系统进行贯序优化试验确定溶剂的组成，先用100%乙腈，然后加水调整乙腈-水的比例，逐步降低溶剂强度。试验结果见下图。可见，采用乙腈-水（40：:60）时分离效果及容量因子均好，此时的洗脱强度因数计算为S=0.43.2+0.60=1.28确定适宜的洗脱强度还可以通过梯度洗脱完成。预分离的某未知混合组分可分三种情况：能够明确组分的种类和数量；只明确含有某种或几种组分，其

25、他组分数量和种类不明确；组分的数量和种类均不明确。例1：对于某未知混合组分的分离，初始试验采用一弱的溶剂系统，如乙腈-甲醇-水（10:10:80），随后使用仪器梯度功能快速线性的把溶剂组成调整成可能的强度最大的流动相，比如乙腈-甲醇-水（40:40:20）。注意初始溶剂系统应比第一组分出峰所需的溶剂系统弱，而结束的溶剂系统应比最后出的峰所需的溶剂系统更强，以保证有合理的选择结果。本例中，第一峰对应的有机溶剂45%，故可尝试采用乙腈-甲醇-水（22.5:22.5：55）为流动相。（a）流动相：乙腈-甲醇-水（10:80，保持3min）箭头乙腈-甲醇-水（40:20，梯度7min，后保持5min）

26、（b）流动相：乙腈-甲醇-水（22.5:55）梯度滞留时间约2分钟梯度系统滞留时间的测定方法例2：取代苯胺混合物等度洗脱条件设计。先进行一个60min梯度试验，以5%100%乙腈-水梯度，谱图如下，标出初峰和末峰的保留时间（tRa和tRb），设tR=tRa-tRb，则比值tR/tG可用于判断等度洗脱的条件，tG为梯度时间，即60min。若要求0.5k20，则tR/tG应小于0.40。本例中，tR/tG=（24.5-9.5）/60=0.250.40，可采用等度洗脱。Snyder等将以上用一次梯度试验寻找等度洗脱合适流动相组成的方法改进发展成为应用表格寻优的洗脱方法。见下表1和表2。表1 等度分离可行性的确定tRa/min允许的tRz/min1k100.5k201.