蛋白质组学答案终稿docWord格式文档下载.docx

1、碎片离子峰在质谱图上位于分子离子峰的左侧。研究最大丰度的离子断裂过程，能提供被分析化合物的结构信息。8.软电离技术 在质谱分析中，离子源是将分子离解成离子或解离成碎片，在这里分子失去电子，生成带正电荷的分子离子。分子离子可进一步裂解，生成质量更小的碎片离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法。通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法，而给样品较小能量的电离方法为软电离方法，后一种方法适用于易破裂或易电离的样品。9.源内衰变技术（insource-decay，ISD）源内衰变发生在离子源区域内，时间为激光撞击之后几百纳秒之内，是离子的“即可片段

2、化”。这些片段离子通过衰减离子取出，能在线性飞行时间质谱中被发现，许多蛋白质和大的肽常在MOLDI-TOF-MS的离子源区域内变成肽离子片段。主要产生含N端的b型和含C端的y型片段离子，通过分析这些片段离子谱可鉴定蛋白质。10. 肽质量指纹图谱 是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于每种蛋白质的氨基酸序列都不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物质量数据也具特征性，这种特征就像指纹一样，所以称为指纹谱。肽质量指纹图谱可用于蛋白质的鉴定，用实验测得的PMF与蛋白数据库中的蛋白质理论PMF比对，就可以鉴定该蛋白质肽序列标签是由一个多肽的部分氨基酸序列

3、和该肽的质量以及该肽未测序部分的质量等组成。11.生物质谱就是运用现代质谱仪器解决生物学问题，如蛋白质测序，生物大分子分子量检测，磷酸化位点检测等生物质谱：主要用于小分子物质研究的质谱技术。它们具有高灵敏度和高质量检测范围。12. 基质辅助激光解吸电离（matrix assisted laser desorption ionization, MALDI）在波长为7751250 nm 的真空紫外光辐射下产生光致电离和解吸作用，从而获得分子离子和含有结构信息的碎片，同时引入基质减少过分碎裂。基质辅助激光解吸电离技术适于结构复杂、不易汽化的大分子。一般采用固体基质，基质与样品比为10000：1。根据

4、分析物不同而使用不同的基质和波长电喷雾电离（Electrospray Ionizsation,ESI ） 利用强静电场从溶液直接产生气态离子化分子的一种方法采用强静电场（35kV），以喷雾形式使液体样品形成高度荷电的雾状小液滴，小液滴经过反复的溶剂挥发-液滴分裂后，产生单个带多电荷的离子，即在电离过程中，产生多种质子化离子。13. 蛋白质芯片 是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA蛋白质、RNA蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等。15. 亚细胞蛋白质组学内涵 针对细胞内不同区域结构功能单位的蛋白质组学研究。细胞内成分根据空间结构

5、、分布及功能不同，分成不同细胞器或细胞区域，如细胞膜、胞浆、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体、内质网、高尔基体和细胞核等。另外，细胞器内一些功能单位多是大分子结构体或多蛋白复合体，如核基质、剪接体、纺锤体、核孔结构以及核糖体等。16. 2D双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。二，简答题 1. 质谱仪结构由7部分组成：进样系统、离子源室、质量分析器、检测器、数据处理系统、真空系统和供电系统。其中离子源

6、室、质量分析器、检测器必须处于高真空状态，离子源要求10-410-5Pa, 质量分析器要求10-6Pa，以降低背景以及减少离子间或离子与分子的碰撞。进样系统：把样品从室内常压转移到离子源。离子源室：把品分子转换成样品离子。（品离子是带有电荷的样品分子。最简单的形成样品离子的方法就是从中行分子里移除一个电子，这样就形成了正离子。样品分子必须变成样品离子才能被质谱所分析。） 在质量分析器里，电场或者磁场，或者两者都有的分析器，被用来控制样品离子的运动，这样便可根据其质量不同而将其分离。虽然有很多不同的质量分析器，但是都执行相同的功能：根据质量分离不同的离子。 检测器可以感知已经被分离的离子的到达，

7、放大极其微小的离子的电流以便进一步的电子处理。虽有很不不同类型的检测器，但作用都一样，就是检测离子并将其转换成较强的电信号。 记录仪接受检测器的信号，将其放大并记录，这样就得到了质谱图。质谱要在真空系统运行。减少空气中成分的干扰。常真空度的范围是室内常压的百万分之一或者十亿分之一。离子源，质量分析器和检测器在真空系统里。2.质谱肽谱分析通过测定肽和蛋白质的分子质量，加上已知蛋白和DNA序列的信息，来试探性的确认给定组织或体液中存在的肽和蛋白质。质谱肽谱分析分4步：（1）从生物组织提取多肽和蛋白质并分馏提取液（2）测定提取液中各组分的分子质量（3）从肽或蛋白质的计算机库中搜索被测的分子质量是否符

8、合特定的肽或蛋白质的质量；（4）再确认分析，如部分N端或C端的测序分析、氨基酸分析或串联质谱分析，这些再确认分析的对象应是那些在（1）（3）步中仍不能十分确认的特定肽或蛋白质3.ESI特点是产生多电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比（m/z）降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。目前可检测分子质量100 000Da以下的蛋白质，最高可达150 000Da。优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液一质联用（LCMS）是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目MALDLI 特点1.MALDAI 源使用的激

9、光是脉冲式，每一脉冲激光产生的离子都先经过一加速电场而获得动能，然后再进入一个高真空无电场飞行管道，离子在此无电场飞行管道内以在加速电场获得的速度匀速飞行。离子越小，飞行速度越快。每一脉冲激光产生一批离子得到一张质谱图，一般使用的是多次脉冲激光扫描质谱峰结果的累加。2.所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的谱峰与样品各组分的质量数有一一对应关系。最适于分析多肽和蛋白质混合物，蛋白质序列分析，制作太指纹图谱，测量化合物分子量等，在基因领域的研究也可以应用于DNA序列测定、DNA点突变、遗传病诊断等。3.MALDAI 源的离子化程度非常高，是灵敏度最高的质谱仪，能对极微量的样品（fmol-a

10、mol）进行分析的。4. 基本原理是将分析物分散在基质分子（尼古丁酸中及其同系物）并形成晶体，当用激光（337nm 氮激光）照射晶体时，基质分子吸收激光能量，又以热的形式将能量释放，样品解吸附，同时基质晶体升华，基质和样品分子气化进入质谱仪的气相。基质-样品间发生电荷转移使样品分子电离。5. 基本原理 主要利用物质在流动相与固定相之间的分配系数差异来实现分离。 6. 1.双向磷酸多肽图谱 2.高分辨率凝胶电泳 3.固相金属亲和色谱4.反相高效液相色谱 5.毛细管电泳6.免疫沉淀7.化学修饰法 8.另外一种修饰手段，不仅可以用来研究磷酸化丝氨酸肽段和磷酸化苏氨酸肽段，还可以研究磷酸化酪氨酸肽段。

11、这方法的显著特点是：通过碳化二乙胺的催化作用将胱氨酸加到磷酸基团上，再通过巯基乙胺与碘乙酰树脂柱的共价结合使磷酸化肽得以纯化。但肽的N端首先用叔丁氧羰基保护；C端进行酰胺化保护，以免复杂反应产生。磷酸肽的洗脱是通过三氟乙酸切割氨基磷酸键完成的。碳化二乙胺方法在质谱分析前，需要多步化学反应和柱纯化过程，所以可能会有大量的样品丢失，而且这种方法只适用于磷酸肽的富集，目前还没有应用于磷酸化蛋白质的富集 7. 原理:质谱是很好的蛋白质鉴定工具，但不同的蛋白质或多肽在质谱中有不同的离子化效率，所以不能从质谱图中对蛋白质进行定量分析。以稳定同位素为内标，将物理化学性质相同、质量不同的同位素掺入两种样品，混

12、合后不同状态的相同蛋白质因质量差异在质谱图中表现为一对峰，通过比较质谱峰强弱，精确定位出蛋白质不同状态下表达量的变化。这就是基于稳定同位素标签和液相色谱与串联质谱联用技术定量和鉴定蛋白质的理论依据。 8. 线粒体的分离纯化基本原则：先制备组织或细胞匀浆，然后进行差速离心，低速去除细胞核及细胞碎片；高速离心分离线粒体，有必要还可进行密度梯度离心。组织细胞的特异性及所要线粒体的实验用途决定了方法的细节。这些细节包括：匀浆器的选择、缓冲液的成分、许可混杂其他细胞器的程度等。通常用Ficoll、Percoll、碘化介质（OptiPrep, Nycodenz, metrizamide）和蔗糖来形成密度梯

13、度进一步纯化线粒体v 纯度鉴定：分离线粒体时可能混杂其他细胞器，线粒体的相对纯度可以通过检测线粒体或其他可能存在的细胞器的标志酶来确定。线粒体纯度最好的方法之一是测定几种标志酶的活性。一方面可检测所分离的线粒体是否保留了其生物学功能，另方面检测其他细胞器污染程度如微粒体、溶酶体等。线粒体组分还可以通过电子显微镜检查。v 9. 1. 富集低丰度蛋白质，完善全细胞蛋白质组2. 提供蛋白质的亚细胞定位信息3. 加深对亚细胞组分的结构功能理解4. 加深对细胞生理分子机制的理解5. 亚细胞蛋白质组的差异表达谱v 10. 1. 细胞器的蛋白质组学研究2. 大分子结构体和多蛋白复合物的蛋白质组学研究3. 酵

14、母的亚细胞蛋白质组学研究4.核蛋白质组的研究11， 蛋白质组学研究任务研究目的􀂙 分离蛋白，显示差异，将表现型与功能联系起来； 寻找蛋白质之间的相互作用，动态地反映生物体所处的状态。12，相互作用网络的研究技术等样品 样品制备样品分离蛋白质点提取鉴定功能确定 生物信息学 图像分析13，1）蛋白质组样品制备基本原则尽可能提高样品溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失解除蛋白质之间以及与其它生物大分子的相互作用，使蛋白质完全处于变性状态和还原状态减少对蛋白质以及蛋白质组的人为修饰（假点）总之：尽可能简单，减少步骤v 14. 一、样品制备的前控制v 1. 染色方法的选择v 采

15、用双向电泳等方法纯化蛋白质，往往需要染色后才能准确获得用于分析鉴定的样品。染色方法与蛋白质分析的灵敏度高度相关，染色效果十分重要。v 2. 污染的控制（角蛋白）在蛋白质组学分析中，常见a-角蛋白的污染，主要来自实验人员的皮肤屑和头皮屑。也有b-角蛋白的污染，来自实验人员穿着的毛衣。v 2）盐分和去污剂v 在进行质谱分析前，应特别注意样品中盐分和去污剂等含量对质谱分析的影响。MALDI-MS分析技术可以耐受一定量的小分子杂质和盐类物质，但样品中含有表面活性剂或其他难溶盐分，则很难产生好的结晶。v 二.样品的制备v 操作步骤及注意事项：v （1）切胶和脱色v 切胶前用ddH2O洗胶2次，每次15m

16、in.v 用干净的刀片从胶上切取蛋白点，将胶块切成1mm3大小，放入200ml Eppendorf管内。切胶时尽量不要超出蛋白点的范围，胶块的大小要适当。胶块太小在以后的抽取步骤中可能被吸掉, 太大不利于脱色、酶切、抽取等步骤。v 1）考马斯亮蓝染色凝胶的脱色v 用50% 乙腈/25mM NH4HCO3 脱至背景无色（也有用50%甲醇）v 2）银染凝胶的脱色v 30 mM 铁氰化钾与100mM 硫代硫酸钠用前1：1混合。脱至无淡黄色溶液产生，吸去溶液，加ddH2O 冲洗。v 脱色后的胶块用100%乙腈脱水后，真空离心干燥2030min15，一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法含氮有机物与浓硫

17、酸共热,即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：H2NCH2COOH+ 3H2SO4 ? 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 （1）2NH3 + H2SO4 ? （NH4）2SO4 （2）（NH4）2SO4 + 2NaOH ? 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 （3）为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如

18、欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。二、双缩脲法（Biuret法）蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中，蛋白质与Cu2+形成紫色络合物，此紫色络合物颜色的深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的相对分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为110ug蛋白质。,三Folin酚试剂法（Lowry法）这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂配制较为困难，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏

19、度。四、紫外吸收法由于蛋白质分子中，酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度与蛋白质含量成正比，可用作定量测定。五、考马斯亮兰法（Bradford法）考马斯亮蓝G250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质含量在01000g范围内，蛋白质一色素结合物在 595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。16，二维凝胶电泳基本原理第一向是等电聚焦，根据蛋白质等电点（pI）不同的分离第二向是SDS-PAGE，根据蛋白质分子量不同的分离。一般采用垂直电泳或水平电泳，两者差别不大，均适于分子量10-150

20、kd的蛋白质。17，二维凝胶电泳图像分析主要步骤包括图像扫描、斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。18，作用原理 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被

21、解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。20SWISS-PROT是经过注释的蛋白质序列数据库，由欧洲生物信息学研究所（EBI）维护。数据库由蛋白质序列条目构成，每个条目包含蛋白质序列、引用文献信息、分类学信息、注释等，注释中包括蛋白质的功能、转录后修饰、特殊位点和区域、二级结构、四级结构、与其它序列的相似性、序列残缺与疾病的关系、序列变异体和冲突等信息。SWISS-PROT中尽可能减少了冗余序列，并与其它30多个数据建立了交叉引用，其中包括核酸序列库、蛋白质序列库和蛋白质结构库等。利用

22、序列提取系统（SRS）可以方便地检索SWISS-PROT和其它EBI的数据库。SWISS-PROT只接受直接测序获得的蛋白质序列，序列提交可以在其Web页面上完成。完整的GenBank数据库包括序列文件，索引文件以及其它有关文件。索引文件是根据数据库中作者、参考文献等建立的，用于数据库查询。GenPept是由GenBank中的核酸序列翻译而得到的蛋白质序列数据库，其数据格式为FastA。GenBank中最常用的是序列文件。序列文件的基本单位是序列条目，包括核苷酸碱基排列顺序和注释两部分。三，论述题1，（1） 酵母双杂交技术酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因

23、转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域（DNA binding domain,DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结构域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子

24、下游基因得到转录。根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性

25、菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。酵母双杂交的优点 快速获得相互作用蛋白的基因 只需单一步骤的质粒构建 在体内鉴定蛋白的相互作用 弱小的，暂时的相互作用也能鉴定 能在整个时间段积聚弱小的相互作用信号缺点 假阳性是酵母双杂交系统的最大问题 假阳性通常由以下原因造成:1. prey蛋白的非特异性结合2. 无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录（这是大多数假阳性的诱因）（2）噬菌体展示技术噬菌体展示技术是在深刻理解噬菌体遗传学和生理学特性的基础上产生的。 其原理是将蛋白质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中，利用目的蛋白质

26、与特异配基的亲和力，筛选和配基特异结合的蛋白质。噬菌体展示技术一般要经过多轮的筛选，这样就可以得到在文库中含量很低的与配基特异作用的蛋白质。优点v 1. 高度选择性v 2. 可以构建大的噬菌体文库（1091010），亲和纯化可在高浓度下进行（大于103噬菌体/ml）v 3. 通过改变洗脱步骤的严格性，来评价融合蛋白结合的特异性。v 缺点：1. 多价展示对于肽段大小的限制2. 蛋白质能被细菌分泌3. 体外实验，蛋白质在细菌内无法正确折叠4.融合蛋白会影响蛋白本身的活性 （3）蛋白质亲和层析（Pull-down）在一定的条件下，某种蛋白质共价连接在基质如琼脂糖上，用以结合抽提物中 能与该蛋白结合的

27、配体蛋白。先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质，再用高盐溶液或SDS洗脱下结合在柱子上的蛋白质。蛋白质需要纯化，通常简单方法是构建融合蛋白，常用的谷胱甘肽S转移酶（GST），可用谷胱甘肽-琼脂糖柱纯化；Staphylococcus 蛋白A在IgG柱上纯化；含His6-Tag的肽段在镍柱上纯化；麦芽糖结合蛋白可在含直链淀粉的柱子上纯化。优点:（1）灵敏度高，在高浓度固定蛋白质条件下 可检测微弱的相互作用（结合常数：10-5mol/L, 生理上相关的最微弱的相互作用在10-3mol/L）（2） 可以同时检测抽提物中所有的蛋白，它们结合机会均等（3） 通过构建突变体，可以检测与特异性相互作用有关的蛋白质

28、结构域或关键的氨基酸残基（4） 检测多亚基蛋白质间的相互作用假阳性：（1）电荷间的相互作用使蛋白质与检测蛋白质结合，可以利用带相同电荷的对照柱来消除（2）通过B蛋白，A蛋白与检测蛋白间接结合（3）两种蛋白质的细胞定位不同，但在认为条件下，却能高特异性结合。（4）免疫共沉淀原理: 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么

29、与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。优点（1）检测细胞裂解原液中所有蛋白质与检测蛋白质的相互作用（2）抗原、抗体相互作用是在生理浓度下被检测的，可排除过量表达带来的假阳性。（3）可检测到体内形成的天然复合体（4）天然蛋白质如果经过翻译后修饰，可以检测到依赖于或不依赖于修饰的蛋白质相互作用缺点：（1）有时免疫共沉淀的蛋白质并非直接相互作用（2）灵敏度不高：抗原浓度低（5） 化学交联法如果两种或两种以上蛋白彼此间存在特异性的亲和性并在生物体内可以形成复合物，可以用该法研究这种相互作用，尤其是瞬时相互作用。使用一种交联试剂，并且在交联试剂的光激活部分带有标记，将该试剂共价耦联到一蛋白质上，耦联物与抽提物一起温育。若抽提物中的A 蛋白能与耦联蛋白质发生相互作用，光激活后交联