USP的HPLC法定方法应用.ppt

1、HPLCHPLC法定方法应用法定方法应用Developing Compendial HPLC Practices章节介绍1、法定方法应用概述2、法定程序的确认3、系统适应性4、色谱柱等效工具法定方法&法定方法应用USP中法定方法源自FDA批准的NDA*、ANDA*中的方法。这些方法可视为经过验证的方法。法定方法应用是指确认法定方法适用于测试某一特定生产商生产的产品。*NDA新药申请（New Drug Application）*ANDA简略新药申请（Abbreviated New Drug Application）为什么需要法定方法应用？实际上，法定方法也许并不适用于所有产品。原因（1）原料药有

2、不同的合成路线 （2）不同剂型有不同的辅料、处方因此，应用法定方法的公司必须证明该方法在实际应用条件下适用。两个概念【验证】证明一个方法适用于它的预期目的的所有必需过程。【确认】阐明已验证方法进行产品测试的条件确实适合于该已验证方法的过程。【法定方法应用的主要内容】即在特定的使用条件下，对特定产品，证明该已验证方法确实适用。如何做确认？以通则作为指导来确认HPLC方法。若经过USP工作人员的帮助仍不能解决问题，则该方法可能不适用于本产品的测试。判断该方法是否适用于测试该产品判断该方法是否适用于测试该产品 如果确认失败，评估失败的原因如果确认失败，评估失败的原因 求助求助USP工作人员工作人员

3、2.产品不适用产品不适用 于该方法于该方法1.用户系统用户系统 不合格不合格法定方法应用下一步当法定方法不适用于本产品时，也许需要开发并验证一个替代方法。若决定开发一个替代方法，可与USP联系，以便评估是否需要将替代方法以合适的方式收录到USP各论中。USP方法不是一成不变的，但需要强大的数据和理论作为支持。USP确认的定义通则：USP-NF的用户不需要验证所收载方法的准确性和可靠性，仅需要确认这些方法在实际使用条件下的适用性。通则：确认中描述的用来采集相关数据的性能参数，而不是重复验证过程。验证 vs 确认验证：使用一个为大家所接受的样品来挑战分析方法。确认：使用一个为大家所接受的方法来挑战

4、分析环境。分析人员分析人员 仪器仪器 试剂试剂 基质基质 确认在这些影响因素的一定变化下确认在这些影响因素的一定变化下 该方法能适用于该产品该方法能适用于该产品 通则本通则意在提供实验室首次使用法定程序确认的通用信息，即如何通过利用实验室人员、仪器、试剂产生可接受结果。相同的条件不需要每次实验重复确认，一次即可。对原料药，辅料，药物制剂均适用。应用范围：滴定，色谱程序（有关物质、含量测定、限度试验），光谱测试等。常规测试（如水分、重金属、炽灼残渣等）通常不需要确认。确认对象的几种类型类型定义原料药或药物制剂活性成分（含防腐剂）中主要的分析程序如含量测定原料药中杂质检查或药物制剂中降解产物的分析

5、程序，包括定量试验或限度试验用于性能参数测试的分析程序（如溶出度，释放度，崩解时限等）鉴别试验（IR，UV等）原料药和辅料确认的数据要素检测技术检测技术类型类型 类型类型 类型类型类型类型定量试验限度试验HPLC/GCPP,S,LOQS,LOD-S光谱法或比色法PP,LOQS,LOD-S滴定法PP-TLC-S,LOQS,LOD-S凝胶电泳-S,LOQS,LOD-SP=精密度；S=专属性；L=线性；LOD=检测限；LOQ=定量限制剂确认的数据要素检测技术检测技术类型类型 类型类型 类型类型类型类型定量试验限度试验HPLC/GCP,S,LP,S,LOQS,LODPS光谱法或比色法P,LP,LOQS

6、,LODPS滴定法P,LP-TLC-S,LOQS,LOD-S凝胶电泳-S,LOQS,LOD-SP=精密度；S=专属性；L=线性；LOD=检测限；LOQ=定量限确认流程USP允许客户在确认标准时有一定自由度确认确认 低 确认程度 高 根据书面程序测试 全面验证 确认 vs 验证（原料）鉴别试验 IR,UV HPLCHPLC纯度检查 干燥失重，炽灼残渣 重金属 pH 有关物质含量测定 滴定法 HPLC *可以根据具体情况选择做或者不做性能参数验证确认准确度NoNo精密度NoNo专属性YesMaybe*LODNoNoLOQNoNo线性NoNo范围NoNo确认 vs 验证（原料）鉴别试验 IR,UV

7、HPLC纯度检查 干燥失重，炽灼残渣 重金属 pH 有关物质（有关物质（HPLCHPLC法）法）含量测定 滴定法 HPLC *可以根据具体情况选择做或者不做性能参数验证确认准确度YesNo精密度YesMaybe*专属性YesYesLODNoNoLOQYesYes线性YesNo范围YesNo确认 vs 验证（原料）鉴别试验 IR,UV HPLC纯度检查 干燥失重，炽灼残渣 重金属 pH 有关物质含量测定 滴定法 HPLC HPLC *可以根据具体情况选择做或者不做 性能参数验证确认准确度YesNo精密度YesMaybe*专属性YesMaybe*LODNoNoLOQNoNo线性YesNo范围Yes

8、No示例1氢溴酸西他罗仑第一试行版收载于PF（Pharmacopeia Forum）A公司采用不同合成路径，评估结果显示HPLC图谱中的氯化物和溴化物类似物是工艺过程中产生的杂质，而该各论的原始申报单位工艺过程中不产生该杂质。在现有PF收载的HPLC条件下，氯化物和溴化物得不到良好分离，需要A公司根据自身情况重新制定合适的方法。示例1氢溴酸西他罗仑解决方案：收载第二方法批准的ANDA要求监控原料药中的氯化物和溴化物类似物。因此，该产品现行各论有两个方法【弹性各论】。分析员根据工艺过程中产生的杂质决定采用哪个方法，且在不同方法中，限度可能不同，根据具体情况弹性选择。示例2奥氮平专属性测试存在一些

9、问题。USP收到另一家企业评论说，在主峰附近存在工艺过程中产生的杂质，在缓冲液：有机相（50：50）条件下分离度无法符合规定。解决方案：改变流动相组成正式各论中改为缓冲液53%：乙腈47%确认 vs 验证（制剂）鉴别试验 HPLCHPLC制剂性能检查 注射剂不溶性颗粒 含量均匀度 溶出度杂质 有关物质 残留溶剂含量测定 *可以根据具体情况选择做或者不做性能参数验证确认准确度NoNo精密度NoNo专属性YesYesLODNoNoLOQNoNo线性NoNo范围NoNo确认 vs 验证（制剂）鉴别试验 HPLC制剂性能检查 注射剂不溶性颗粒 含量均匀度 溶出度溶出度杂质 有关物质 残留溶剂含量测定

10、*可以根据具体情况选择做或者不做性能参数验证确认准确度Maybe*Maybe*精密度YesYes专属性Maybe*YesLODMaybe*NoLOQMaybe*Maybe*线性Maybe*No范围Maybe*No确认 vs 验证（制剂）鉴别试验 HPLC制剂性能检查 注射剂不溶性颗粒 含量均匀度 溶出度杂质 有关物质有关物质 残留溶剂含量测定 *可以根据具体情况选择做或者不做性能参数验证确认准确度YesMaybe*精密度YesYes专属性YesYesLODNoNoLOQYesYes线性YesNo范围YesNo确认 vs 验证（制剂）鉴别试验 HPLC制剂性能检查 注射剂不溶性颗粒 含量均匀度

11、溶出度杂质 有关物质 残留溶剂含量测定含量测定 *可以根据具体情况选择做或者不做性能参数验证确认准确度YesMaybe*精密度YesYes专属性YesYesLODNoNoLOQYesYes线性YesNo范围YesNo示例3加兰他敏片问题1：有关物质检查未列出所有已知杂质问题2：已知杂质限度达不到批准限度。研究：采用已知杂质加入法进行评价结论：采用现有方法，所有已知杂质都可以成功鉴定（这是一个成功的确认过程），但杂质限度仍不达标。解决方案：该厂家提供中期修订声明修改各论USP接受，将某杂质限度放宽，使大多数生产商的产品都能符合要求。通则通则色谱系统适应性，提供了用于解释和应用标准的基本指导原则，

12、以避免在整本标准的大量各论中重复这些要求。对于每个具体品种，各论优先于通则。系统适用性定义：系统适用性实验是气相和液相色谱分析方法的组成部分。它们用于证明该分析试验的色谱系统具有足够的分离度和重现性，该试验是基于由仪器、电子、分析方法和待分析样品所构成的系统能够以这种方式进行评价。为某一特定方法所确定的系统适用性试验参数取决于该已经验证方法的类型。系统适用性个论中指定的规格参数并不排除可使用其他合适的操作条件，用户可根据自身需要适当调整操作条件，以满足系统适用性的要求。在整个运行过程中，在合理的时间间隔内，通过注射进样合适的对照品以证明系统适用性。所使用的仪器设备必须经过检验合格，并且在进样前

13、或分散在样品间，重复进样所规定的标准对照品，以证明仪器可以达到足够的系统精密度，方可进行测试。系统适用性无论何时，若设备或者关键试剂有显著变化时，必须在进样前进行适用性实验。必须在满足系统适用性要求的前提下才能进行样品分析。系统适用性测试失败所得到的样品分析结果是不可接系统适用性测试失败所得到的样品分析结果是不可接受的。受的。适用性测试要求重复性分离度拖尾因子（T）容量因子（k）理论塔板数（N）*在各论中，相对保留时间仅供参考，以方便峰的鉴别，但USP对RRT并没有统一规范的要求，不作为一项控制参数。适用性测试要求重复性：当RSD2.0%时，n=6理论塔板数：最常用的是在半峰高处计算拖尾因子T

14、：在5%峰高处计算信噪比（S/N）：也是一个常用的系统适应性参数。S/N=2h/hn其中h是主峰峰高；hn是至少5倍半峰宽内最大和最小噪音之差，且应尽可能选择在主峰附近。系统适应性允许的改变调整条件以满足系统适用性要求是必要的。色谱生效于USP30第二增补版。“用户通过评估因变化而受影响的相关表现，验证在新的条件下方法的适用性”在允许的波动范围内，只需要作简单的确认，当变化超过该范围时，需要对新方法进行全面验证。系统适应性允许的改变改变因素允许波动的范围备注流动相pH+0.2%EP要求在中性附近时只允许+0.1%变动流动相缓冲盐浓度+10%有人反应太宽，在商榷中流动相比例+30%检测波长不允许

15、柱长+70%柱内径+30%填料尺寸+50%只允许从大到小，不能相反柱温+10%流速+50%进样量可减不可增示例1柱尺寸盐酸昂丹司琼（收录于USP29），有关物质D含量和限度测定标准是使用20cm长柱。问题：非商业尺寸，不常见，难买选择较短的柱子：有减少分离度的风险选择较长的柱子：没有风险验证：使用常见的25cm柱子，验证分离度在多个试验中，应用25cm柱得到的分离度2.0结果：各论在USP30中将柱长修订为25cm。示例2流动相比例盐酸帕罗西汀问题：在原流动相Buffer:ACN:TEA=60:40:1的条件下，要求拖尾因子2.5但始终无法满足要求很明显应该减少有机溶剂比例以增加分离度，问题是

16、增加多少？根据通则，流动相比例变化可为+30%意味着最极限可以采用72%水相和28%乙腈，需要确定该变化对系统适应性的改善如何。示例2流动相比例条件：流动相：0.05M醋酸铵（pH4.5）:乙腈:三乙胺=70:30:1 色谱柱：25cm*4.6mm，填料L3 柱 温：30 流 速：1.0 mL/min得到的系统适应性参数：拖尾因子：1.8 不合格 分 离 度：2.5 合格思考影响拖尾因子的原因：主要为柱温和流动相比例示例2流动相比例在25和70：30，75：25流动相比例时，分离度都是合适的，但拖尾因子均未达要求。在审查多批API的数据和含量值后，专家委员会决定认为拖尾因子定到2.0是合理的。温度（）拖尾因子分离度251.92.7301.82.5401.82.1流动相比例拖尾因子分离度65：351.71.670：301.82.575：251.93.2示例2流动相比例因此，按现有比例醋酸缓冲盐:乙腈:三乙胺（70:30:1）修订各论，根据通则，三者比例可以在70:40:1到75:25:1之间自行调整。当联系该方法原始研发者时发现，原始研发者已在内部将流动相修改为70:40:1，但未通知U