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1、 培养方式1 . 根据培养方式 固体培养（Solid culture ） 液体培养（Liquid culture ） 液体培养又有液体悬浮培养与静置培养之分。 固液培养（Solid- liquid culture ） 看护培养（ Nurse culture ） 饲喂层培养 （Feeder layer culture） 微室培养 （Microchamber culture） 最常用的是固体培养和液体培养，它们相比，各自的优缺点表现为：固体培养 优点：通气性较好，若有污染，只污染局部 缺点：使培养材料与培养基接触不充分，有毒物质易积累。液体培养有利于培养材料与培养基充分接触且有毒物质不易积累。缺点

2、：一旦污染，则材料全部污染，且通气性不好。 2 根据培养过程 初代培养（Primary culture） 从活体植株上切取下来进行的第一次培养。 继代培养（Subculture） 经过初代培养的材料，转移到新鲜培养基上进行培养的过程。 3. 根据培养材料（外植体） 组织培养 器官培养 胚胎培养 细胞培养 原生质体培养二、植物组织培养的培养基1. 无机营养（Inorganic element） 根据国际植物生理协会的建议：将植物所需元素的浓度以0.5 mmol/L为标准分为大量元素与微量元素。2.有机化合物 糖是组培材料必不可少的碳源和能源，此外糖类的添加还有调节培养基的渗透压的功能。最常用的碳

3、源是蔗糖，葡萄糖、果糖也是较好的碳源。3。植物生长调节剂生长素与细胞分裂素的比例决定着形态分化的方向。4. 凝固剂、pH和其他成分第二章 植物细胞形态建成一、愈伤组织的诱导1、概念 愈伤组织:原指植物组织受到伤害后表面形成的保护组织。在组织培养中,是指在培养基上由外植体长出来的一团活跃生长的薄壁细胞。用途：愈伤组织可以通过液体悬浮培养产生单细胞， 也可以在适当的培养条件下再生出完整的植株。2、诱导1）. 外植体的选择大小要适宜,不宜太小。外植体的组织块要达到2万个细胞（5-10mg）以上才容易成活；同一植物不同部位的外植体，其细胞的分化能力、分化条件及分化类型有相当大的差别；通常植物胚与幼龄组

4、织器官比老化组织、器官更容易去分化，产生大量的愈伤组织；不同物种相同部位的外植体其分化能力可能大不一样。理论上讲用于培养的外植体包括根、茎、叶、果实、子房、花粉、花瓣等各种器官或组织。但外植体的选择一般以幼嫩的组织或器官为宜。2）. 外植体的消毒3）. 愈伤组织诱导过程 起动期 又称为诱导期，是愈伤组织形成的起点。这时在外观上虽然未见明显变化，但实际上细胞内一些大分子代谢动态已发生明显的改变，细胞正积极为下一步分裂进行准备。 分裂期 外植体切口边缘开始膨大，外层细胞通过一分为二的方式进行分裂，从而形成一团具有分生组织状态细胞的过程。这时组织细胞代谢十分活跃，发生了一系列生理生化及形态的变化。

5、形成期 是指外植体的细胞经过诱导、分裂形成了具有无序结构的愈伤组织时期。这个时期特征是细胞大小不再发生变化，愈伤组织表层的分裂逐渐减慢和停止，接着内部组织细胞开始分裂，细胞数目进一步增加。4）. 愈伤组织的形态特征 质地不同的愈伤组织之间有时是可以互换的，有时则是不可逆的。 不同类型之间的愈伤组织互换主要通过改变激素浓度的方法来实现。培养基中加入高浓度的生长物质，可使坚实的愈伤组织变为松脆；反之，减少或去除生长物质，则使松脆的愈伤组织转变为坚实的愈伤组织。二、继代培养 愈伤组织培养一段时间后必须转移到新鲜培养基上以保持培养物的继续正常生长，更换一次培养基称为一代继代培养（subculture）

6、 。 为什么要进行继代培养？ 培养基中的养分大量消耗； 培养基中的水分散失； 琼脂培养基褐化或发黑（因为植物组织在培养前几周有时会产生毒素物质，这些物质会扩散进入培养基）; 由于植物材料的原因使培养基pH降低，导致培养基液化； 生长物已充满培养瓶，培养物扩繁的需要；三、器官建成 形态建成，又叫形态发生，指有机体生长发育中组织结构和生理功能发生一系列变化，形成或再生成特定结构和器官的过程。 器官建成：又叫器官发生，指培养细胞在适宜的诱导培养条件下产生不定芽和不定根等器官的过程。1. 器官发生在适合的激素浓度和配比以及温光条件下，愈伤组织细胞会发生生理代谢上的改变，促使细胞分裂部位和方向改变，首先

7、出现分生细胞，经细胞分裂逐渐形成分生细胞团和分生组织，进一步再分化形成维管结节直至分化成芽和根等器官。2. 植株再生的方式 先芽后根 根芽同生 先根后芽3. 影响器官建成的因素影响器官建成的因素1外植体 物种、种、甚至品种间再生能力是不同的 同一植株不同器官或同一器官不同部位的外植体，其再生能力不同； 外植体在原植物体上所达到的发育程度和结构与功能对器官离体再生也有较大差异； 取材时间（季节）不同再生能力不同； 外植体的大小对再生也有较大影响。影响器官建成的因素2培养基成分 植物激素的浓度、比例 乙烯 碳源的种类和浓度影响器官建成的因素3培养环境条件 培养基的物理状态液固状态、渗透压 培养基的

8、化学性质pH 光照光照时间、光照强度、光照周期 （连续/间隔）、光质 温度四、体细胞胚胎建成 体细胞胚胎建成：又叫体细胞胚胎发生，指诱导体细胞形成体细胞胚，并进一步再生出完整植株的过程。体细胞胚又叫胚状体，是组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的具有双极性的胚状结构 。 从胚状体的这个概念可以看出： 胚状体不同于合子胚，因为它不是两性细胞融合的产物； 胚状体不同于孤雌胚或孤雄胚，因为它不是无融合生殖的产物； 胚状体不同于组织培养中通过器官发生途径形成的茎芽和根，因为它的形成须经历与合子胚相似的发育过程，而且成熟的胚状体是一个双极性结构。1.体细胞胚胎的产生方式 胚状体

9、一般来源于单细胞，可以从愈伤组织表面产生，也可以从外植体表面或内部已分化的细胞或悬浮培养的单个细胞产生。2. 体细胞胚的发育 一个正常胚的发育一般要经过球形、心形、鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期，最后发育成完整的小植株。但有些植物如柑橘胚培养胚状体的发育可能缺乏某一形态时期，这种胚状体有时称为畸形胚。五、人工种子人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到的类似种子的单位。 胚（胚状体）：胚状体、不定芽、顶芽和腋 人工胚乳的成分：培养基+植物激素+有益微生物+杀虫剂+除草剂+。 人工种皮：要求不但能控制种子内水分和营养物质的流失, 而且能通气和具有机械保

10、护作用。如，藻酸钠。2. 人工种子的特点 不受季节限制，可周年生产； 短期内可以获得大量材料，可对一些“珍、稀、奇、特”以及基因工程植物进行大量繁殖； 不会造成性状改变，方便运输和储藏； 目前，生产成本较高尚不能进行商业化生产。第三章、植物离体快繁技术一、概念植物离体快繁又叫微繁，是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。二、离体快繁的一般方法 无菌培养物的建立1、采样外植体的选择原则：外植体类型的选择，一定程度上是由所要采用的茎芽繁殖方式决定的。外植体的生理状态对茎芽的反应能力有明显的影响 选取相对较为幼嫩、生长能力较强的部位的材料2、消毒根

11、据外植体的特点选择适宜的消毒剂种类、浓度和消毒时间进行外植体的表面消毒。参考第一章外植体的消毒技术。3、接种4、培养 茎芽的增殖1、原球茎途径 原球茎：是兰花的种子发芽过程中特有的一种形态学结构，是缩短的、成珠状、由胚性细胞组织的类似嫩茎的器官。 在组培中常从茎尖或侧芽的培养中产生。2、胚状体途径利用体细胞胚状体来进行无性系的大量繁殖具有极大的潜力。其特点是：繁殖系数高、成苗快、结构完整不存在嵌合现象3、不定芽途径叶腋和茎尖以外的任何其他地方所形成的芽，由愈伤组织分化出的茎芽也称为不定芽。4、顶芽和腋芽萌发途径 无根苗的生根1、试管内生根方法：把大于1cm的芽苗，接入生根培养基诱导生根。诱导条

12、件：（1）较低的无机盐浓度 常采用1/2或1/4强度的MS培养基或低无机盐的White培养基。（2）生长素 加入适量的生长素（较常用的是NAA和IBA） ，可促进根的诱导 。（3）较低的糖浓度 降低糖浓度也有利于根的诱导。（4）一定的光照强度 有研究表明，较强的光照能促进根的发育，并使植株变得坚忍。 绝大多数植物在2-4周内即可生根 .2、试管外生根离体条件下形成的枝条作为微插条进行扦插生根。 壮苗、炼苗和移栽移栽注意事项: 第一，移栽前必须把附着于小苗根部的培养基清洗干净，以免由于污染而导致小苗死亡；同时注意避免根颈部损伤引起小苗感染。第二,移栽时介质要疏松通气，保水但滤水性能好。常用的介质

13、以粗粒状的蛭石、珍珠岩、草炭、粗沙或将它们以一定的比例混合应用较好。 第三，移栽后保持小苗的水分供需平衡。常采用加覆塑料薄膜或烧杯等措施尽量使植株周围空气湿度接近100，使叶面蒸腾减少，同时注意使植株的生活环境保持与周围空四、离体无性繁殖存在的一些问题 一、物种的局限性 二、无性系变异 三、培养物污染 四、玻璃化玻璃化是植物组织培养中特有的一种生理失调或生理病变。玻璃化苗与正常苗相比，其特点有： 生长速度下降，甚至最后死亡； 植株矮小肿胀，节间很短或几乎没有，叶片水渍化，半透明，厚而狭长，皱缩或纵向卷曲，脆弱易碎，叶片缺少角质层，没有功能性气孔。 显微观察表明，玻璃化苗叶片没有栅栏组织，仅有海

14、绵组织。 生理生化研究表明，玻璃化苗细胞中含水量高、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素等含量低； 此外，一些酶的活性也发生了变化。 五、褐化褐化是指培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基和培养材料逐渐变褐而死亡的现象。是离体繁殖中发生比较普遍的一种现象。 褐化的发生与植物种类和品种、外植体年龄、大小和取材时间等都有一定关系。 培养基的物理状态及成分、继代时间及培养环境对褐化的发生也有重要的影响。六、黄化黄化是试管苗整株失绿，全部或部分叶片黄化、斑驳的现象。五、离体无性繁殖的商业化生产植物离体快繁的理论增殖值的计算 Y=mXn Y：代表年理论增殖总数 m：代表外植体个数 X：代表增殖倍数 n：代

15、表年理论增殖周期数第四章、无病毒苗培育五、植物脱毒方法 1. 热处理原理：病毒和寄主细胞对高温的忍耐程度不同，选择适当的温度和处理时间，可使寄主体内病毒的浓度降低，运行速度减慢或失活，而寄主细胞仍然存活，并加快分裂和生长，从而达到脱毒的目的。不足：不能排除所有病毒，而且处理效果不一。 康乃馨花叶病毒在40 下处理，顶部病毒虽有减少，但基部病毒仍很多。 热处理对部分球状病毒（葡萄扇叶病毒、苹果花叶病毒）或线状病毒（马铃薯X、Y病毒）有效，而对杆状病毒则不起作用。 2. 茎尖培养病毒在植物体内的分布不均匀，顶端分生组织无病毒或病毒浓度低。 3. 微型嫁接脱毒 4. 胚培养与珠心胚培养 5. 愈伤组

16、织培养愈伤组织是一系列排列疏松的细胞，带毒植株上取得外植体诱导形成的愈伤组织，并不是每个细胞含病毒。因此，由愈伤组织再生的植株部分不含病毒。 6. 热处理+茎尖培养六、脱病毒植株的检测和鉴定 直接观察法 指示植物鉴定法植物病毒病都有一定的寄主范围，并在某些寄主植物上表现特定的症状，这种能鉴别某种病毒的植物通常称为指示植物或鉴别寄主。指示植物是指对某种或某几种病毒及类似病原物或株系有敏感反应，并表现明显症状的植物。（1）指示植物法的意义（2）指示植物的要求指示植物对所指示的病毒类病原物敏感指示植物对所指示的病毒类病原物专一表现症状快易于繁殖七、脱毒苗植株的保存和繁殖 保存 脱毒植株并不具有特殊的

17、抗病性，可重新被感染，因此脱毒植株应建防虫纱网温室内保存。 繁殖 脱毒植株的繁殖可采用任何离体快繁的方法，但由于通过愈伤组织再生时变异频率高、不定芽再生时发生嵌合的几率大，所以多数情况下采用芽生芽的方式。第五章 单倍体和多倍体的培养一、花药、花粉培养的概念及意义二、花药培养的方法1、外植体的选择 外植体的遗传背景、生理状态和花粉发育时期。 选择花粉发育适宜时期（一般是单核中晚期到双核早期）的花蕾。 镜检花粉发育时期，并根据发育时期与花蕾大小、外观形态和颜色等的相关性，选择适宜的花蕾。2、材料预处理 取花粉发育适宜的花蕾进行预处理，低温处理一般在3-5处理3-10d，高温处理一般在35处理1-3

18、d。为避免花蕾失水，可将花蕾置于内装有浸湿的滤纸的培养皿中进行处理。 3、材料消毒 消毒方法与其它组织消毒相同。4、接种 尽可能地避免花药受到损伤；接种速度尽量快；注意接种密度。5、培养 1）基本培养基 因植物不同所用基本培养基不同，MS、N6、B5等。 2）糖浓度和糖的种类 培养基中蔗糖浓度比其它组织培养高，尤其早期培养，一般5%10%。原因是花粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高，即高浓度的蔗糖不利于药壁、花丝等体细胞的生长，而利于花粉的生长。3） 激素 激素种类和浓度对花药和花粉培养很重要。大多数植物花药培养的诱导培养用2,4-D 和KT，但有些植物用BA和NAA。一般来说，高浓度2,4-D

19、主要诱导花药形成愈伤组织，不能形成胚状体，增加了二倍体细胞发育的机会，所以2,4-D激素水平要相对较低。花药壁分化程度高，重新分裂需要较高的激素浓度才能启动。因此，花药培养激素水平要相对较低才能抑制二倍体细胞的分裂。确定适宜的激素浓度，使花粉细胞分裂的同时又抑制花药二倍体细胞分裂是成功获得单倍体的关键。4）培养方式和培养条件 培养方式：固体培养 液体培养 双层培养 培养条件： 温度 光照 6、单倍体植株的诱导7、单倍体植株的加倍 秋水仙素诱导加倍三、影响花药培养的因素1、基因型 不同基因型的培养难易及植株再生有很大差别。2、供体植株的生理状态和环境条件 供体植株的年龄和所经历的环境条件如：光周

20、期、光照强度、温度等对以后的花粉离体培养有很大影响。一般田间比温室，幼龄比老龄植株易于培养。3、花粉发育时期 只有发育到某一时期的花粉对离体刺激才最敏感。 因此选择合适的花粉发育时期的花药很关键，多数植物单核期（单核后期）的花粉培养容易成功。4、预处理 花粉或花药从植株上取下来直接培养，往往诱导频率极低，采用低温、高温、离心等预处理方法可以促进花粉启动，提高再生频率。5、培养基成分 基因型不同，所需培养基种类，蔗糖浓度以及添加激素种类和浓度不同。加入活性炭可提高花粉植株的诱导率。6、花药壁因子7、培养方式与培养条件五、胚乳培养二、影响胚乳形成愈伤组织的因素：1）胚乳发育时期 发育早期的胚乳，接

21、种不方便，愈伤组织的诱导频率很低。 处于旺盛生长期的胚乳，离体条件下最易诱导产生愈伤组织。 接近成熟或完全成熟的胚乳，愈伤组织诱导频率很低。2）培养基（WT、MS、LS植物激素） 对一般植物，生长素细胞分裂素合理搭配，效果更好。 大麦2,4-D、猕猴桃玉米素 枣+任何一种生长素（无特别要求）3）胚在胚乳培养中的作用 旺盛期的未成熟胚乳，在诱导培养基上无需原位胚的参与，就能形成愈伤组织。 完全成熟的胚乳，生理活动很弱，在诱导脱分化前，必须借助于原位胚的萌发，使其活化。可能原因是胚在萌发时产生某种物质“ 胚因子”。外源GA3能部分取代胚因子。4）其他因素 培养基中的蔗糖浓度、光照、pH等。三、胚乳

22、愈伤组织再生植株1、胚状体途径2、器官发生途径第六章 原生质体培养与融合一、原生质体概念以及原生质体研究中的几个重要成就原生质体（protoplast）：指去除细胞壁的裸露的具有活力的植物细胞。 核质体（nuclearplast） ：由原生质体膜和薄层细胞质形成的小原生质体，也称为微小原生质体（miniprptoplast）。 胞质体（cytoplast）：不含细胞核而只含部分细胞质的原生质体。二、原生质体分离2、影响原生质体分离的因素外植体来源 生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响着原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生。 用于原生质体分离的植物外植体有叶

23、片、叶柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、原球茎、花瓣、叶表皮、愈伤组织和悬浮培养物等。前处理 进行表面消毒，除非材料来源于无菌条件。 为了保证酶液充分进入组织， 可撕去叶片下表皮，如果叶片的下表皮撕不掉或很难撕掉，可把叶片切成小块，如果是其他组织可直接切成小块。为了促进酶液的渗入也可结合真空抽滤。 此外，高渗处理、激素处理、低温处理、激素处理与低温处理结合等方法。 分离培养基分离植物原生质体的酶液主要由分离培养基、酶和渗透压稳定剂组成。 常用的分离培养基主要是CPW盐溶液，也有用钙（CaCl22H2O）和磷（KH2PO4）盐组成的溶液或1/2MS盐溶液等。酶的种类和浓度 常用的酶有纤维素酶、半纤维

24、素酶、果胶酶和离析酶，酶解花粉母细胞和四分体小孢子时还要加入蜗牛酶。 酶的水平应根据不同植物材料而有所变化。常用的纤维素酶浓度是1%3%，果胶酶为0.1%0.5%，离析酶为0.5%1%，半纤维素酶为0.2%0.5%。渗透压稳定剂酶液中渗透压对平衡细胞内的渗透压、维持原生质体的完整性和活力有很重要的作用。一般来说，酶液、洗涤液和培养液中的渗透压应高于原生质体内的渗透压；较高的渗透压可防止原生质体破裂或出芽，但同时也使原生质体收缩并阻碍原生质体再生细胞分裂。酶解条件和时间 酶解时间视材料而定，范围为2-8h，一般不超过24h。 酶解的温度一般为23-32； 酶解的pH值因使用酶的不同而不一样，一般

25、在5.65.8，过高或过低均不适于原生质体分离。四、原生质体融合（一）、概念 原生质体融合（protoplast fusion），是指不同亲本的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。 表示方法：“a（+）b”，其中a和b是两个融合亲本，（+）表示体细胞杂交。 几种表述方式 细胞融合（cell fusion） 体细胞杂交（somatic hybridization） 超性杂交（parasexual hybridization） 超性融合（parasexual fusion）（二）、原生质体融合的方法1、自发融合 2、诱发融合 （三）、原生质体融合的方式 对称融合 非对称融合 配

26、子-体细胞融合 亚原生质体-原生质体融合（四）、体细胞杂种的筛选与鉴定3、杂种植株的鉴定 形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。 细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定、染色体原位杂交。 生化鉴定：同功酶鉴定。 分子鉴定：RFLP、RAPD、SSR等分子标记鉴定（五）、体细胞杂种的核质遗传概念 核遗传：双亲之和，少数有重组和丢失。 线粒体遗传：往往有重组，柑橘上例外，仅来自愈伤组织亲本。 叶绿体遗传：随机分离，也有共存现象。第七章 植物遗传转化一、 植物基因工程的研究现状1.植物基因工程的概念 植物基因工程是以植物为受体的一种基因操作，即以分子生物学为理论基础，采用基因克隆、遗传转化，以及细

27、胞、组织培养技术将外源基因转移并整合到受体植物的基因组中，并使其在后代植株中得以正确表达和稳定遗传，从而使受体获得新性状的技术体系。5. 植物遗传转化的分类遗传转化根据是否需要载体分为非载体介导的遗传转化和生物载体介导的遗传转化。二、 植物基因工程载体的种类载体（vector）是将外源基因送入受体细胞的工具。目前所用的载体有细菌的质粒、噬菌体或病毒，但更多使用的是改造过的载体。 1.质粒载体质粒载体:质粒是细菌染色体外存在的一种能够自我复制的双链闭合环状DNA分子，其大小从1kb到200kb不等。可以自我复制和传代。各种不同类型的Ti质粒都具有T-DNA区、毒性区、质粒复制起点、质粒结合转移位点和冠瘿碱