光谱分析法-研究生课程实例.ppt

1、常见现代仪器分析技术常见现代仪器分析技术：1.1.光谱分析技术：光谱分析技术：紫外紫外-可见分光光度计、荧光分析仪器、可见分光光度计、荧光分析仪器、原子光谱分析仪原子光谱分析仪2.2.显微镜显微镜:光学显微镜和电子显微镜光学显微镜和电子显微镜3.3.分离分析技术：分离分析技术：离心机、色谱仪、电泳仪、毛细管电泳离心机、色谱仪、电泳仪、毛细管电泳仪仪4.4.细胞及分子生物学技术：细胞及分子生物学技术：培养箱、培养箱、PCRPCR基因扩增仪基因扩增仪5.5.波谱分析技术：波谱分析技术：质谱仪质谱仪6.6.常规仪器分析技术：常规仪器分析技术：生物安全柜、免疫分析仪生物安全柜、免疫分析仪2第一章第一章

2、 光谱分析法光谱分析法（Spectrum Analysis）2本章提要本章提要第一节第一节 光谱分析法概论光谱分析法概论第二节第二节 紫外紫外/可见光吸收光谱法可见光吸收光谱法!光谱分析法及其特点光谱分析法及其特点!电磁辐射的基本性质电磁辐射的基本性质!电磁辐射的特性电磁辐射的特性!光谱分析法的分类光谱分析法的分类!分子光谱法分子光谱法!基本原理基本原理!紫外紫外/可见分光光度计构造可见分光光度计构造!紫外紫外/可见分光光度计类型可见分光光度计类型3第三节第三节 分子发光光谱法分子发光光谱法!光致发光光致发光!分子荧光和磷光光谱基本原理分子荧光和磷光光谱基本原理!影响荧光强度的因素影响荧光强度

3、的因素!分子荧光光谱仪分子荧光光谱仪!分子荧光光谱法的应用分子荧光光谱法的应用!磷光光谱法磷光光谱法!化学发光法化学发光法4本章提要本章提要第一节第一节 光谱分析法概论光谱分析法概论5（1 1）能源提供能量；）能源提供能量；（2 2）能量与被测物之间的相互作用；）能量与被测物之间的相互作用；（3 3）产生信号。）产生信号。基本特点：基本特点：（1 1）所有光分析法均包含三个基本过程；）所有光分析法均包含三个基本过程；（2 2）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；（3 3）涉及大量光学元器件。）涉及大量光学元器件。三个基本过程：三个基

4、本过程：一、一、光谱分析法及其特点光谱分析法及其特点8二、电磁辐射的基本性质二、电磁辐射的基本性质 电磁辐射（电磁波）：电磁辐射（电磁波）：以接近光速（真空中为光速）以接近光速（真空中为光速）传播的能量；传播的能量；c=/E=h=h c/c：光速；光速；：波长；波长；：频率；频率；：波数：波数；E：能量；：能量；h：普朗克常数：普朗克常数 电磁辐射具有波动性和微粒性电磁辐射具有波动性和微粒性（波粒二象性）；（波粒二象性）；9三、辐射能的特性：三、辐射能的特性：(1)吸收吸收 物质选择性吸收特定频率的辐射能，并从低能级跃物质选择性吸收特定频率的辐射能，并从低能级跃迁到高能级；迁到高能级；(2)发

5、射发射 将吸收的能量以光的形式释放出；将吸收的能量以光的形式释放出；(3)散射散射 由传播介质的不均匀性引起的光线向四周射去由传播介质的不均匀性引起的光线向四周射去；(4)折射折射 折射是光在两种介质中的传播速度不同；折射是光在两种介质中的传播速度不同；(5)反射反射 光射到不同的介质介面时，部分光自介面射回原介质光射到不同的介质介面时，部分光自介面射回原介质中；中；(6)干涉干涉 干涉现象；干涉现象；(7)衍射衍射 光绕过物体而弯曲地向他后面传播的现象；光绕过物体而弯曲地向他后面传播的现象；(8)偏振偏振 只在一个固定方向有振动的光只在一个固定方向有振动的光。10常用三种光常用三种光分析法测

6、量分析法测量过程示意图过程示意图 11四、光谱分析分类四、光谱分析分类光谱分析法光谱分析法原原子子发发射射原原子子吸吸收收原原子子荧荧光光X X射射线线荧荧光光原原子子吸吸收收紫紫外外可可见见红红外外可可见见核核磁磁共共振振紫紫外外可可见见红红外外可可见见分分子子荧荧光光分分子子磷磷光光核核磁磁共共振振化化学学发发光光原原子子发发射射原原子子荧荧光光分分子子荧荧光光分分子子磷磷光光X射射线线荧荧光光化化学学发发光光吸收光谱法吸收光谱法发射光谱法发射光谱法原子光谱法原子光谱法分子光谱法分子光谱法12五、分子光谱法五、分子光谱法物质分子内部运动形式及其对应能级物质分子内部运动形式及其对应能级1.电

7、子相对于原子核的运动电子相对于原子核的运动-电子能级电子能级;单重态：激发态与基态中的电子自旋方向相反单重态：激发态与基态中的电子自旋方向相反.三重态：激发态与基态中的电子自旋方向相同三重态：激发态与基态中的电子自旋方向相同.2.原子核在其平衡位置附近的相对振动原子核在其平衡位置附近的相对振动-振动能级振动能级;3.分子本身绕其重心的转动分子本身绕其重心的转动-转动能级转动能级.13分子的能级图与跃迁分子的能级图与跃迁S Sn n:电子能级电子能级V Vn n:振动能级振动能级J Jn n:转动能级转动能级分子的总能量分子的总能量=E电子电子+E振动振动+E转动转动14 分子光谱分析法的分类分

8、子光谱分析法的分类分分子子光光谱谱分子吸收分子吸收分子发光分子发光光致发光光致发光其它发光形式其它发光形式UV-Vis（紫外（紫外-可见）可见）IR（红外）（红外）如：荧光和磷光如：荧光和磷光如：化学发光等如：化学发光等15第二节第二节 紫外紫外/可见光吸收光谱法可见光吸收光谱法16紫外紫外/可见光吸收光谱分析法可见光吸收光谱分析法：利用溶液中分子吸收紫外和可见光产生跃迁所记录的利用溶液中分子吸收紫外和可见光产生跃迁所记录的吸收光谱图，可进行化合物结构分析，根据最大吸收波长吸收光谱图，可进行化合物结构分析，根据最大吸收波长强度变化可进行定量分析。强度变化可进行定量分析。属于分子吸收光谱法，分析

9、波属于分子吸收光谱法，分析波长范围一般为长范围一般为200800nm。历史悠久、应用广泛：历史悠久、应用广泛：分析化学分析化学药物分析药物分析临床检验等临床检验等第二节第二节 紫外紫外/可见光吸收光谱法可见光吸收光谱法17 即光吸收基本定律即光吸收基本定律即光吸收基本定律即光吸收基本定律即光吸收基本定律即光吸收基本定律朗伯定律朗伯定律:(1760):(1760)A=lg(I0/It)=k1b 当入射光的当入射光的当入射光的当入射光的、吸光物质的、吸光物质的、吸光物质的、吸光物质的c c 一定时，溶液的吸光度一定时，溶液的吸光度一定时，溶液的吸光度一定时，溶液的吸光度A A与液与液与液与液层厚度

10、层厚度层厚度层厚度b b成正比。成正比。成正比。成正比。比尔定律比尔定律(1852)1852)A=lg(I0/It)=k2c 当入射光的当入射光的当入射光的当入射光的、液层厚度、液层厚度、液层厚度、液层厚度b b 一定时，溶液的吸光度一定时，溶液的吸光度一定时，溶液的吸光度一定时，溶液的吸光度A A与吸光与吸光与吸光与吸光物质的物质的物质的物质的c c成正比。成正比。成正比。成正比。一、一、基本原理基本原理I0It入射光入射光透过光透过光18朗伯朗伯-比尔定律比尔定律 意义意义意义意义:当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点

11、的浓度和吸收层厚度的乘积成正比。吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比。A=lg(I0/It)=kbc一、一、基本原理基本原理19透光率（透射比）透光率（透射比）透光率（透射比）透光率（透射比）T T（TransmittanceTransmittance）A=lg(I0/It)=lg(1/T)=-lgT =kbc吸光度吸光度吸光度吸光度A A （AbsorbanceAbsorbance）一、一、基本原理基本原理20吸光度吸光度吸光度吸光度A A、透射比透射比透射比透射比T T 与与与与浓度浓度浓度浓度c c 的关系的关系的关系的关系AT(%)cA=kbc1.00.80.60.40.21

12、00 80 60 40 20一、一、基本原理基本原理21k k 吸光系数吸光系数吸光系数吸光系数 （AbsorptivityAbsorptivity）（1）当）当c的单位用的单位用gL-1表示时，用表示时，用a 表示，表示，Aa b ca 的单位的单位:Lg-1cm-1 的单位的单位:Lmol-1cm-1（2）当）当c的单位用的单位用molL-1表示时，用表示时，用表示，表示，A b c （3）当当c的单位用的单位用g100mL-1表示时，用表示时，用 表示表示,A bc，叫做比吸光系数。叫做比吸光系数。一、一、基本原理基本原理22溶液浓度的测定溶液浓度的测定A b c工作曲线法工作曲线法(校

13、准曲线校准曲线)朗伯朗伯朗伯朗伯-比尔定律的分析应用比尔定律的分析应用比尔定律的分析应用比尔定律的分析应用 0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL)A。*0.800.600.400.200.00Axcx一、一、基本原理基本原理26朗伯朗伯朗伯朗伯-比尔定律的适用条件比尔定律的适用条件比尔定律的适用条件比尔定律的适用条件1.单色光单色光 应选用应选用 max处或处或肩峰处肩峰处测定。测定。3.稀溶液稀溶液 浓度增大，分子之间作用增强。浓度增大，分子之间作用增强。2.吸光质点形式不变吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系离解、络合、缔合会破坏线性关系,应控制条件应控制条件(酸

14、度、浓度、介质等酸度、浓度、介质等)。一、一、基本原理基本原理27吸光度的加和性与吸光度的测量吸光度的加和性与吸光度的测量吸光度的加和性与吸光度的测量吸光度的加和性与吸光度的测量 A=A1+A2+An 用参比溶液调用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。一、一、基本原理基本原理28二、紫外二、紫外/可见分光光度计主要部件可见分光光度计主要部件光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测系统检测系统分光光度计的基本组成分光光度计的基本组成 习惯上将工

15、作波段在习惯上将工作波段在200nm800nm的分光光度的分光光度计称为紫外计称为紫外-可见分光光度计。可见分光光度计。优点：优点：优点：优点：通过色散原件（棱镜或光栅）得到一束近似的单色光。通过色散原件（棱镜或光栅）得到一束近似的单色光。波长可调波长可调,故选择性好故选择性好,准确度高。准确度高。29/nm钨灯（热辐射光源）钨灯（热辐射光源）40040060060080080010001000氙灯氙灯氢灯氢灯强强度度光源光源（发出所需波长范围内的连续光谱）发出所需波长范围内的连续光谱）发出所需波长范围内的连续光谱）发出所需波长范围内的连续光谱）可见光区：可见光区：钨灯，卤钨灯钨灯，卤钨灯(3

16、202500nm)紫外区：紫外区：氢灯氢灯 (180375nm)氙灯、汞灯氙灯、汞灯：紫外、可紫外、可见光区均可用作光源见光区均可用作光源要求要求：有足够的光强度，稳定。有足够的光强度，稳定。二、紫外二、紫外/可见分光光度计主要部件可见分光光度计主要部件30氙灯氙灯氢灯氢灯钨灯钨灯31单色器单色器（将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置）（将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置）（将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置）（将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置）棱镜棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同。依据不同波长光通过棱镜时折射率不同。玻璃玻璃3503200nm,石英石英1854000 nm入射狭缝入射狭缝准直透镜准直透镜棱镜棱镜聚焦透镜聚焦透镜出射狭缝出射狭缝白光白光红红紫紫1 12 2800 600 500400二、紫外二、紫外/可见分光光度计主要部件可见分光光度计主要部件32光栅光栅：（利用光通过光栅时发生利用光通过光栅时发生衍射衍射和和干涉干涉现象而分光的装置现象而分光的装置）光栅衍射示意图光栅衍射示意图光屏光屏透透镜镜平面透平面透射光栅射光栅M1M2出出射射狭狭缝缝在镀