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1、Western blot 实验技术 定义：n印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。n1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。n而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法Western Blot基本原理基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种

2、固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。快速、特异，信号弱、昂贵快速、特异，信号弱、昂贵信号强、二抗选择多，非特异性结合信号强、二抗选择多，非特异性结合Western Blot一般流程nSDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳l转膜l封闭l一抗杂交l二抗杂交l底物显色n蛋白样品的制备蛋白样品的制备蛋白样品的制备裂解液只能识别非变性的抗原表位的抗体，不能选择只能识别非变性的抗原表位的抗体，不能选择只能识别非变性的抗原表位的抗体，不能选择只能识别非变性的抗原表位的抗体，不能选择SDSSDSSDSSDS及强去污剂的裂解液及强去污剂的裂解液及强去污剂的裂解液及强去污剂的裂解液研究蛋白之间相互作用，应选择温和非变

3、性裂解液研究蛋白之间相互作用，应选择温和非变性裂解液研究蛋白之间相互作用，应选择温和非变性裂解液研究蛋白之间相互作用，应选择温和非变性裂解液对于难溶解蛋白，应选用裂解强度更高的裂解液（如对于难溶解蛋白，应选用裂解强度更高的裂解液（如对于难溶解蛋白，应选用裂解强度更高的裂解液（如对于难溶解蛋白，应选用裂解强度更高的裂解液（如RIPA,SDS)RIPA,SDS)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理原理：SDS SDS 是一种离子性的界面活性剂是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链性的长碳链.当当 SDS SDS 与蛋白质混合时与蛋白质混合时

4、,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋大多数蛋白质和白质和 SDS SDS 的平均结合量是的平均结合量是 1:1.4(1:1.4(以重量为单位以重量为单位),),而蛋白质结合固定而蛋白质结合固定比例之比例之 SDS SDS 後後,由於由於 SDS SDS 带强负价带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道使蛋白质原先的带电价微不足道,且且每单位重量之蛋白质带电价一致每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),(charge density)

5、,所以决定不同蛋白所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素的泳动速率就只剩下分子大小一项因素M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 MSDSM配胶的Tris缓冲液MTEMEDM过硫酸铵(时间)MTris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成份凝胶成份凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围安装玻璃板安装玻璃板安装玻璃板安装玻璃板对齐、加紧对齐、加紧对齐、加紧对齐、加紧配胶配胶配胶配胶混匀、不要过度，防止氧化混匀、不要过度，防止氧化混匀、不要过度，防止氧化混匀、不要过度，防止氧化转膜转膜NCNCNCNC膜膜膜膜PVDFPVDFPVDFPVDF膜膜膜膜结合能力结合能力结合能力结合能力80-110 ug

6、/cm80-110 ug/cm80-110 ug/cm80-110 ug/cm2 2 2 2125-200 ug/cm125-200 ug/cm125-200 ug/cm125-200 ug/cm2 2 2 2材料质地材料质地材料质地材料质地脆脆脆脆韧性好韧性好韧性好韧性好溶剂耐受性溶剂耐受性溶剂耐受性溶剂耐受性无无无无有有有有操作程序操作程序操作程序操作程序缓冲液润湿缓冲液润湿缓冲液润湿缓冲液润湿100%100%100%100%甲醇润湿甲醇润湿甲醇润湿甲醇润湿价格价格价格价格便宜便宜便宜便宜较贵较贵较贵较贵大于大于20KD0.45 um小于小于小于小于20KD0.2 um小于小于小于小于7K

7、D0.1 um转膜半干法半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间。（小分子量蛋白）湿法湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。（大分子量蛋白）不能有气泡不能有气泡不能有气泡不能有气泡不要污染膜的表面不要污染膜的表面不要污染膜的表面不要污染膜的表面注意正负极注意正负极注意正负极注意正负极冰浴冷却冰浴冷却冰浴冷却冰浴冷却湿转半干转不能有气泡不能有气泡不能有气泡不能有气泡滤纸、胶、膜大小要一致，否则容易短路，产热滤纸、胶、膜大小要一致，否则容易短路，产热滤纸、胶、膜大小要一致，否则容易短路，产热滤纸、胶、膜大小要一致，否则容易短路，产热封闭n n脱脂奶粉（脱脂奶

8、粉（5 5）n nBSABSAn nWestern Blot Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）膜封闭液（生物试剂公司提供）一抗、二抗孵育n把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37一小时，4 过夜。n倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10min。n加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，37一小时，4 过夜。n倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10min。二抗与底物反应显色辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法(HRP)DAB 显色法：方便、经济，反应慢、不易保

9、存、不显色法：方便、经济，反应慢、不易保存、不显色法：方便、经济，反应慢、不易保存、不显色法：方便、经济，反应慢、不易保存、不能重新剥离检测能重新剥离检测能重新剥离检测能重新剥离检测ECLECL发光法：灵敏、快速、反应快、能重新剥离检测发光法：灵敏、快速、反应快、能重新剥离检测发光法：灵敏、快速、反应快、能重新剥离检测发光法：灵敏、快速、反应快、能重新剥离检测Western Blot常见问题分析常见问题分析SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳电泳电泳u胶不平？胶不平？胶不平？胶不平？u凝胶漏液？凝胶漏液？凝胶漏液？凝胶漏液？胶板洗刷干净胶板洗刷干净胶板洗刷干净胶板洗刷干净加入加入加入加入A

10、PSAPSAPSAPS和和和和TEMEDTEMEDTEMEDTEMED的量要合适的量要合适的量要合适的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混加入试剂后摇匀，使其充分混加入试剂后摇匀，使其充分混加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀合，防止部分胶块聚合不均匀合，防止部分胶块聚合不均匀合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶温度合适，受热不均匀导致胶温度合适，受热不均匀导致胶温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀聚合不均匀聚合不均匀聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐uu条带比正常的窄？条带比正常的窄？条带比正常的窄？条带比

11、正常的窄？uu“微笑微笑微笑微笑”或或或或“倒微笑倒微笑倒微笑倒微笑”条带？条带？条带？条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓均匀，动作轻缓均匀，动作轻缓均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲以免把上样带扭曲以免把上样带扭曲以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致样品盐浓度过高会挤压其他条带导致样品盐浓度过高会挤压其他条带导致样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽

12、窄不一，纯化样品，调整盐浓度宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应胶板底部有气泡会影响电泳效果，应胶板底部有气泡会影响电泳效果，应胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适合适合适合适转膜及抗体检测转膜及抗体检测转膜及抗体检测转膜及抗体检测uu凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？uu条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？uu单个或多个白点

13、？单个或多个白点？单个或多个白点？单个或多个白点？uu转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡中浸泡中浸泡中浸泡5-10min5-10min5-10min5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，“三三三三明治明治明治明治”结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的滤纸绵之间垫上少

14、许普通的滤纸绵之间垫上少许普通的滤纸绵之间垫上少许普通的滤纸确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温背景太高1.1.膜没有均匀浸湿膜没有均匀浸湿2.2.膜或者缓冲液污染膜或者缓冲液污染3.3.封闭不充分封闭不充分4.4.抗体与封闭剂出现交抗体与封闭剂出现交叉反应叉反应5.5.抗体浓度过高抗体浓度过高 原原因因对对策策1.1.转

15、膜前用转膜前用100%100%甲醇将膜完甲醇将膜完全浸湿全浸湿2.2.拿取膜与吸水纸时要戴手拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液套，更换新鲜转膜缓冲液3.3.检测一抗、二抗与封闭剂检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应是否有交叉反应4.4.杂交前检测一抗、二抗的杂交前检测一抗、二抗的工作浓度工作浓度没有阳性条带或比较弱1.1.抗体染色不充分抗体染色不充分2.2.靶蛋白含量太低靶蛋白含量太低3.3.HRPHRP抑制剂抑制剂4.4.转膜时间不够转膜时间不够5.5.曝光时间过短曝光时间过短 原原因因对对策策1.1.增加抗体滴度，延长孵育增加抗体滴度，延长孵育时间时间2.2.增加样本上样量增加样本上样量3.3.所用溶液和容器中避免含所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠有叠氮化钠4.4.大分量蛋白相应增加转膜大分量蛋白相应增加转膜时间及曝光时间时间及曝光时间弥散性条带或非特异性条带1.1.抗体浓度太高抗体浓度太高2.2.蛋白上样量太多蛋白上样量太多3.3.交叉反应交叉反应 原原因因对对策策1.1.降低抗体浓度降低抗体浓度2.2.降低样本上样量降低样本上样量