免疫沉淀IP 免疫共沉淀coIP 染色体免疫沉淀ChIPWord下载.docx

1、所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者4完成外，最为关键的是裂解液的成份。用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂解液为例（主要含有pH7.4左右的离子缓冲液，接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等）来说明其各主要成份的用途，进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。a. 缓冲液：离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。b. NaCl浓度一般习惯用150 mM,这

2、主要是因为150 mM接近生理浓度，不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的，局部NaCl的浓度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。c. 甘油由于其粘性，可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。d. 裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜，也同时破坏了许多细胞器的膜，从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中，主

3、要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶，通过Protease Cocktail（多种蛋白酶抑制剂混合物）可以抑制蛋白酶。e. 去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果：- 细胞质/器膜的通透性：因为许多目的蛋白都定位在细胞器中，所以必须先将这些蛋白释放出来，抗体才能与之反应。- 膜蛋白的释放：许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感，因此针对这类蛋白的免疫

4、沉淀实验，需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。- 蛋白相互作用：不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样，需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测，所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。二、 抗体-agarose beads孵育裂解细胞，离心并去除不可溶的膜组份后，上清可以储存在-80保存3个月，但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A或者G beads孵育过夜，也可以同时加入抗

5、体和Protein A或者G beads孵育过夜。一般选择1mg总蛋白（1mg/ml）对应添加1 ug抗体，最高可以添加至5 ug抗体，过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的IgG,但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如，做膜蛋白A的免疫沉淀，选择膜蛋白B来做阴性对照，只要确认二者之间没有相互作用；而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀，则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时，为避免Protein A或者G beads有（非）特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性，一般在加入目的蛋白抗体之前，预先将Protein A或者

6、G beads与细胞裂解液孵育数小时，然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。同时，Protein A或者G beads对不同类型的抗体亲和力不同，结合一抗的种属和Ig亚型，选择合适的Protein A或者G beads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用Protein A和Protein G beads的混合物，这样可以达到最佳实验效果，而且省去了许多选择的烦恼。三、 抗体-agarose beads复合物洗涤：除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外，去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。一般洗

7、涤缓冲液使用和裂解液一样的配方，但去除甘油，以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求，还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例，种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如，针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验，但蛋白质之间的结合比较牢靠，可以考虑使用低浓度（0.2-0.5%）的SDS洗涤抗体-agarose beads复合物，这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。四、 鉴定免疫沉淀实验用途非常广泛（见IP: Q&A），而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段（比如免疫共沉淀，染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀），因此，免疫沉淀

8、实验的鉴定方法主要视实验目的而定。我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要注意的实验环节。由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加Protein A/G beads与样品孵育，因此在最后离心获得抗体-agarose beads复合物后，eppendorf管中主要含有抗体，目的蛋白，Protein A/G beads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中，抗体和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之间是以非共价健结合在一起，只有Protein A/G与agarose beads是共价结合在一起的。因此，最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去Protein

9、A/G beads后，eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白，由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子（55KD）和轻链分子（25KD）。因此，WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外，如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话，还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大（1ug），所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时，重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。针对上述情况，通常有二种解决办法

10、：a. 选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验，这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验，就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。b. 使用交联剂将抗体和Protein A/G beads交联，然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarose beads复合物，最后离心去除抗体-agarose beads复合物，上清中只留下目的蛋白。免疫共沉淀（Co- Immunoprecipitation, Co-IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理是，

11、在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白兴趣蛋白抗兴趣蛋白抗体Protein A或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。免疫共沉淀优点（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； （2）蛋白的相互作用是在自然状态下进

12、行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物免疫共沉淀缺点（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。一 原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质

13、间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在

14、实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 二、准备工作： 预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS； 2. 加入预冷的RIPA Buffer（1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶） 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上） 4. 4，14000g离心15min，立即将上清

15、转移到一个新的离心管中 5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 6. 每1ml总蛋白中加入100l Protein A琼脂糖珠（50%），4摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景 7. 4，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子 8. （Bradford 法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20保存一个月） 9

16、. 用PBS将总蛋白稀释到约1 g/l，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 g/l） 10. 加入一定体积的兔抗到500l总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异 11. 4缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育 12. 加入100l Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 l过渡抗体（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG） 13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的R

17、IPA buffer洗3遍，800l/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS 14. 用60l 2上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 l足够上三道） 15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。 RIPA Buffer配制： 基础成分： Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性） NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集） NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存

18、液） 去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存） 注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。 RIPA蛋白酶抑制剂 苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存） EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH 7.4） 亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20保存） 抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20保存） 胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-2

19、0保存） RIPA磷酸（酯）酶抑制剂 激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protoco） NaF（200mM的储存液，室温保存）在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂 工作液配制： 配制100ml的modified RIPA buffe： 1. 称取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4 2. 加10 ml 10%的NP-40 3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清 4. 加1 ml

20、 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8保存 5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 l; PMSF, Na3VO4, NaF各500 l），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。 各种成分在工作液中的终浓度： * Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 * NP-40: 1% * 去氧胆酸钠：0.25% * NaCl: 150 mM * EDTA: 1 mM * PMSF: * 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1

21、 g/ml * Na3VO4: * NaF: 三、实验流程为： （1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4C， 最大转速离心30 min后取上清； （2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1g相应的抗体加入到细胞裂解液，4 （3）取10l protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min； （4）将预处理过的10l protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连； （5）免

22、疫沉淀反应后，在4C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗34次；SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟； （6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白 1用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。 2将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4以最大速度离心15 min。 3收集上清（约30 ml）并加入30g的适当抗体，4摇动免疫沉淀物1 h。 4加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，

23、4摇动免疫沉淀物30 min。 5用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次。 6吸出混合物的液体部分。加入800l的1SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min。 7将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜。 8通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。 9从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min。 10 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。 11 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降

24、解测序。 四、注意的问题： （1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或Triton X-100）。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2SDS），细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的 cocktailer。 （2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用 （3）使用对照抗体： 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体：正常兔IgG 在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点： （1） 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的

25、使用有助于避免污染的发生； （2） 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀； （3） 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。染色质免疫共沉淀技术（ChIP）真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定

26、长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越

27、来越重要的作用。染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。染色质免疫共沉淀原理它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部