上海市自然科学基金标书2Word文档格式.docx

1、“金属材料学科”则填写“E0100”。七、本提纲制订单位是上海市科学技术委员会。填写简表注意事项1课题名称：要确切反映申请资助的研究工作内容（限20字）。2凡有多个的选择性栏目，请将所选项前的打，且只能选择一项。3学科代码：填写本研究课题所属学科。学科代码表A 数理科学0100数学，0200力学，0300天文学，0400物理学I（凝聚态物性；原子和分子物理；声、光学和其他），0500物理学II（基础物理；核物理；粒子物理；等离子物理和其他）B 化学科学0100无机化学，0200有机化学，0300物理化学，0400高分子化学，0500分析化学，0600化学工程及工业化学，0700环境化学C 生命

2、科学0100基础生物学，0200农业科学，0300医学与药学（0301预防医学与卫生学，0302基础医学，0303临床医学基础研究，0304药物学，0305中医药学，0306其他）D 地球科学0100地理学、土壤学和遥感，0020地质学，0300地球化学，0400地球物理学和空间物理学，0500大气科学，0600海洋科学E 工程与材料科学0100金属材料学科，0200无机非金属材料学科，0300有机高分子材料学科，0400冶金与矿业学科，0500机械工程学科，0600工程热物理与能源利用学科，0700电工学科，0800建筑环境与结构工程学科，0900水利学科F 信息科学0100电子学与信息系统

3、，0200计算机科学，0300自动化科学，0400半导体科学，0500光学和光电子学G管理科学0100管理科学与工程，0200工商管理，0300宏观管理与政策一、简 表研究课题课题名称大鼠脑缺血后癫痫发生机制的实验研究研究类别 其它起止年月2003年11 月至2006年10月申请金额 5.0 万元其它经费来源无 经费预算（万元）科研业务费实验材料费仪器设备费组织实施费其它费用2.02.20.30.2课题负责人姓名邱永明性别男 出生年月1965年 10月职称教授学位博士专业神经外科所在单位名称上海第二医科大学附属仁济医院详细地址上海市山东中路145号性质其它主管单位上海市卫生局主要研究内容及意义

4、（摘要）本课题采用先进的全脑缺血后声源性癫痫模型及已有的大鼠大脑中动脉栓塞后癫痫模型，研究脑缺血后癫痫的发病机制，特别是谷氨酸谷氨酸转运体系统在痫性发作中的作用及时空变化规律。同时，应用反义技术降低谷氨酸转运体的表达，应用GDNF诱导升高谷氨酸转运体的表达，进一步探讨癫痫治疗的新途径，为临床最终攻克癫痫提供科学的理论依据和安全有效地治疗方法，必将具有广阔的应用前景。该课题关于癫痫机制的在体研究研究国内外尚属空白。预期研究成果（摘要）（限80字）二、立论依据本课题的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处癫痫与脑缺血关系密切，成为脑缺血的主要早期及晚期并发症之一（图一）。最常见于心脏

5、骤停（cardic arrest）及中风患者。而颅脑外伤及蛛网膜下腔出血所致的癫痫，脑缺血亦为其主要原因。临床调查显示，脑缺血后痫性发作以早期发作多见，中风后24小时内发生率最高（43）（1）。实验研究发现，大于50的脑缺血患者有明显的痫性发作，而“无抽搐”（NCS）痫性发作较实际估计更高。并且缺血后痫性发作参与脑缺血的病理过程，并可伴随缺血的全过程（PLEDs及IRDA），加重了缺血性损伤。形成脑缺血痫性发作脑缺血加重痫性发作加重残障（癫痫）的恶性循环（2）。更有研究发现，脑缺血后最初一周的痫性发作与神经功能恢复及晚发癫痫的发生率密切相关（3）。实验研究发现，脑缺血后癫痫的发作在半小时左右（

6、4,5），且至缺血后2周的痫性发作仍为早发癫痫（early onset）。而超过两周的痫性发作称为晚发癫痫（late onset）（6）。以谷氨酸为主的兴奋性氨基酸在缺血后癫痫的发生中起着关键的作用，是缺血后痫性发作的“闸门”。大量研究显示，脑缺血再灌流后，大量的兴奋性氨基酸聚集在胞外间隙，作用与突触后膜的离子型，代谢型及海仁酸受体，引起内向的钠钙离子流。膜电位去极化，痫性发作的阈值降低，诱发了痫性发作。同时，激发一系列下游事件，造成神经元的坏死或者凋亡（7）。如何减轻兴奋性氨基酸的毒性作用，从而关闭缺血性损害的闸门，对于降低缺血后痫性发作，减轻缺血损害，具有极为重要的意义（8）。 Takag

7、i等研究证明脑缺血后兴奋性氨基酸立即迅速升高并于1小时内降至基线水平，与缺血性的神经元损伤密切相关（9）。这种兴奋性氨基酸的峰状释放（spike release）与痫性活动的后发放（after discharge）极不一致。Seki等在体研究表明，谷氨酸转运体不仅清除胞外兴奋性氨基酸，而且还可以逆向转运将胞内的谷氨酸释放，导致胞外的谷氨酸升高，造成神经元的损伤（10）。Phillis 等还发现应用竞争性的转运体阻滞剂可使前脑缺血时谷氨酸释放降低至少50（11）。谷氨酸转运体的逆向转运及不同的时空变化导致的胞外兴奋性氨基酸的升高在脑缺血后的继发病理改变中（如痫性发作，神经元的凋亡及坏死）的作用研

8、究甚少。Bonde C等在离体海马脑片中研究发现谷氨酸转运体的逆向转运的确加重了氧葡萄糖剥夺（OGD）诱导的神经元损伤（12）。在哺乳动物中枢神经系统中，兴奋性神经递质L谷氨酸的浓度必须保持在低水平以保证突触活动时的较高的信噪比，并防止由于谷氨酸受体的过度激活而造成神经元的损伤。此控制过程由高亲和力的钠离子依赖的分布于神经元或者周围神经胶质细胞膜表面的谷氨酸转运体来完成，即内源性的谷氨酸重吸收机制主要由谷氨酸转运体来承担，谷氨酸转运体重吸收及逆向转运是唯一有效的调节突触间隙兴奋性氨基酸浓度的机制（13）。谷氨酸转运体功能的变化直接影响着脑缺血性损害的后果及痫性发作的发生。目前，已克隆动物（人类

9、）的谷氨酸转运体有五种，分别为：（图二）GLAST（EAAT1）,GLT1（EAAT2）,EAAC1（EAAT3,refs8,9）,EAAT4（refs9-11）,EAAT5（refs1-5）。免疫细胞化学研究发现前两种主要分布在胶质细胞上，而后三种则主要定位于神经元细胞。EAAT4和EAAT1的研究发现，这两种谷氨酸转运体分布在突触外接近释放位点的突触周细胞膜上，这种分布有利于快速结合谷氨酸。并对突触后反应的幅度进行调节。EAAT4主要分布在小脑。EAAC1主要分布在大锥体细胞及浦肯野氏细胞，而并未分布在谷氨酸能神经元细胞膜上。EAAC1主要分布在皮质海马及尾壳核，并且作为突触前后的成分而存

10、在。GLT-1则分布在全脑（主要分布在前脑）的星型细胞膜上。GLAST主要分布在贝格曼神经胶质及小脑的分子层，同时也见于皮质及海马和深部小脑核（14）。谷氨酸转运体的功能状态是决定缺血后神经元损伤程度及痫性发作等并发症的最重要因素。由此我们推测，缺血后由于谷氨酸转运体的（GLT-1及EAAC1）的功能改变（neuroprotective to neurodegenertive）及逆向转运（reversal transport），从而导致谷氨酸在胞外间隙的再次大量聚集，是诱发脑缺血后痫性发作的主要作用机制。研究兴奋性氨基酸及其转运体在脑缺血及痫性发作时的变化规律，探讨其在癫痫发生发展中的作用，必

11、将为癫痫的机制研究及治疗开辟崭新的途径。谷氨酸转运体是近年研究的热点，而对于在缺血导致痫性发作中的具体机制研究甚少。我们欲从兴奋性氨基酸及其转运体的变化及其相互调控的角度研究缺血后痫性发作的具体机制。本课题采用先进的全脑缺血后声源性癫痫模型及已有的大鼠大脑中动脉栓塞后模型，通过转基因技术及反义技术，研究脑缺血后癫痫的发病机制，特别是谷氨酸谷氨酸转运体系统在痫性发作中的作用。为临床最终攻克癫痫提供科学的理论依据和安全有效地治疗方法，必将具有广阔的应用前景。此项研究国内外尚属首次。 图一：脑缺血与癫痫损害与抗损害机制示意图注：Glutamine：谷氨酰胺 Glia cell：胶质细胞Glutama

12、te：谷氨酸 Matabotropic GluR：代谢型谷氨酸受体 VGLuT：囊泡谷氨酸转运体（突触前） Ionotropic：离子型谷氨酸受体 Presynapse：突触前 EAAT15：谷氨酸转运体15图二：兴奋性氨基酸及其转运体系统（15）参考文献：1、 Silverman IE, Restrepo L, Mathews GC. Poststroke seizures. Arch Neurol. 2002 Feb;59（2）:195-201.2、 Anthony J. Williams , Frank C. Tortella. Neuroprotective effects of th

13、e sodium channel blocker RS100642 and attenuation of ischemia-induced brain seizures in the rat. Brain Research 932 （2002） 4555.3、 Lamy C, Domigo V, Semah F, Arquizan C, Trystram D, Coste J, Mas JL; Patent Foramen Ovale and Atrial Septal Aneurysm Study Group. Early and late seizures after cryptogeni

14、c ischemic stroke in young adults. Neurology. 2003 Feb 11;60（3）:400-4.4、 Lu XC, Williams AJ, Tortella FC. Quantitative electroencephalography spectral analysis and topographic mapping in a rat model of middle cerebral artery occlusion. Neuropathol Appl Neurobiol. 2001 Dec;27（6）:481-95.5、 R.G. Geocad

15、ina, R. Ghodadrab, T. Kimurac, H. Leib, D.L. Shermanb,D.F. Hanleya, N.V. Thakor A novel quantitative EEG injury measure of global cerebral ischemia. Clinical Neurophysiology 111 （2000） 17791787.6、Afsar N, Kaya D, Aktan S, Sykut-Bingol C. Stroke and status epilepticus: stroke type, type of status epi

16、lepticus, and prognosis. Seizure. 2003 Jan;12（1）:23-7.7、Rao VLR, Rao AM, Dogan A, Bowen KK, Hatcher J, Rothstein JD, Dempsey RJ （2000） Glial glutamate transporter GLT-1 down-regulation precedes delayed neuronal death in gerbil hippocampus following transient global cerebral ischemia. Neurochem Int 3

17、6:531-5378、White BC, Sullivan JM, DeGracia DJ, ONeil BJ, Neumar RW, Grossman LI, Rafols JA, Krause GS. Brain ischemia and reperfusion: molecular mechanisms of neuronal injury. J Neurol Sci. 2000 Oct 1;179（S 1-2）:1-33.9、Lipton P （1999） Ischemic cell death in brain neurons. Physiol Rev 79:1431-1568.10

18、、Seki Y, Feustel PJ, Keller RW, Tranmer BI, Kimelberg HK （1999） Inhibition of ischemia-induced glutamate release in rat striatum by dihydrokinate and an anion channel blocker. Stroke 30:433-44011、Phillis JW, Ren J, ORegan MH （2000） Transporter reversal as a mechanism of glutamate release from the is

19、chemic rat cerebral cortex: studies with DL-threo-benzyloxyaspartate. Brain Res 868:105-112.12、Bonde C, Sarup A, Schousboe A, Gegelashvili G, Noraberg J, Zimmer J. GDNF pre-treatment aggravates neuronal cell loss in oxygen-glucose deprived hippocampal slice cultures: a possible effect of glutamate t

20、ransporter up-regulation. Neurochem Int. 2003 Sep-Oct;43（4-5）:381-8.13、Danbolt NC. Glutamate uptake. Prog Neurobiol. 2001 Sep;65（1）:1-105.14、Jackson M, Song W, Liu MY, Jin L, Dykes-Hoberg M, Lin CI, Bowers WJ, Federoff HJ, Sternweis PC, Rothstein JD. Modulation of the neuronal glutamate transporter

21、EAAT4 by two interacting proteins. Nature. 2001 Mar 1;410（6824）:89-93.15、Shigeri Y, Shimamoto K. Pharmacology of excitatory amino acid transporters （EAATs and VGLUTs）. Nippon Yakurigaku Zasshi. 2003 Sep;122（3）:253-三、研究方案1课题研究的总目标和创新点，主要研究内容及所需要解决的技术难点（专利技术二次开发课题要描述通过创新形成新的专利技术）。目标及创新：（1） 通过研究脑缺血后兴奋性

22、氨基酸转运体与癫痫发生的关系，探讨缺血后癫痫的发病机理，是本课题的一个新思路。（2） 在此基础之上，应用反义技术降低转运体的表达，应用GDNF诱导升高谷氨酸转运体的表达（up regulation）（Bonde C，et al ,2003），结合在体微透析技术（ in vivo microdialysis ,）进一步阐明癫痫发作的机制，同时，提供了有效的治疗手段。对缺血后癫痫的转运体在体反义阻断及GDNF诱导升高谷氨酸转运体的过表达研究，本实验尚属首创。（3） 首次在癫痫模型中完整比较了两种转运体在转运胞外兴奋性氨基酸的作用及在痫性发作中的不同表达，进一步为痫性发作的机制及治疗提供丰富的理论依

23、据。（4） 首次完整选用了致癫痫的缺血模型（包括全脑缺血及局灶性缺血），为全面认识及揭示脑缺血与癫痫的内在联系建立了了良好的操作平台。研究内容及技术难点：内容：（1） 脑缺血致癫痫动物模型的制作。（2） 痫性放电的记录，胞外谷氨酸浓度的检测，谷氨酸转运体表达及分布的特点。相应突触后神经元胞内钠离子及钙离子浓度变化特点。反义阻断及转运体过表达前行为学评分及神经功能评分。梗塞面积的计算。（3） 反义寡核苷酸（ODNs）的设计及GDNF（胶质源性神经生长因子）的脑内立体定向注射。（4） 反义阻断及转运体过表达后对谷氨酸浓度，谷氨酸转运体表达分布的影响，痫性放电变化及癫痫发生率，梗塞面积，行为学变化，

24、神经功能评分的影响。（5） 两种转运体在缺血后癫痫发生中的作用的比较。关键问题：1、全脑缺血后声源性癫痫动物模型的制作及短暂性大脑中动脉栓塞（MCAo）后的长时程脑电检测。2、反义寡核苷酸（ODNs）的设计。3、在体立体定向微型真空泵侧脑室注射反义寡核苷酸及GDNF（胶质源性神经生长因子）的脑内立体定向注射。应用全脑缺血及局灶性脑缺血后痫性发作的动物模型相结合，通过反义技术研究癫痫发病机制及治疗手段，本课题尚属首创。动物模型的稳定及分子生物学技术的稳定至关重要。2拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析方法：（1）建立脑缺血后癫痫的动物模型：包括胸部挤压伤后的声源性癫痫模型（全脑缺血后

25、癫痫模型）及大脑中动脉栓塞（MCAO）致痫性活动的动物模型。（2）反义寡核苷酸立体定向侧脑室注射降低转运体的表达致缺血后痫性发作的变化的实验研究根据已报道的大鼠的GLT-1及EAAC1的基因序列（Rothstein et al., 1996）设计合成反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides （ODNs）。正义及随机ODN作为对照。正义ODNs序列，反义序列及随机序列分别为 5-ATC AAC CGA GGG TGC CAA CAA TAT-3 （GLT-1 sense）, 5-ATA TTG TTG GCA CCC TCG GTT GAT-3 （GLT-1

26、antisense）, 5-AAT TGT GTT AGC CCC CTC TGT TGA-3 （GLT-1 random）, 5-GCT CGG GAT GCG ACT GGC-3 （EAAC1 sense）, 5-GCC AGT CGC ATC CCG AGC-3 （EAAC1 antisense）, and 5-GCG GAT CCG TAC GCC CAG-3 （EAAC1 random）. 冻干的（ODN）溶解在人造脑脊液中 。应用立体定位仪，准确定位大鼠 侧脑室并预植微导管（参照Paxinos and Watson （1998）大鼠脑解剖图谱），渗透性微量真空泵埋置于大鼠颈部皮下以

27、注射反义寡核苷酸。以1l/hr的速率恒速泵入侧脑室，平均每天注射60ug。5 天注射后，大鼠分为全脑缺血组和局灶性脑缺血组及对照组。在体微透析技术及高效液相色谱检测海马及前脑各区的谷氨酸浓度，收集透析液后，分离荧光检测。应用埋置皮层（10导联）电极，长时程动态监测受试动物的脑电活动。并将其分为缺血前及缺血后1小时，2小时，6小时，24小时，48小时，72小时，直至2周。观察癫痫发生率，行为学的变化，神经功能评分的变化。分析脑电功率谱的变化。TTC染色检测梗塞面积（计算）。应用western blot及免疫细胞化学的方法检测上述模型中海马及前脑谷氨酸转运体GLT-1及EAAC1的表达及分布的影响

28、。并研究此时，相应突触后神经元钠通道电流幅度，开放概率及游离钙离子（共聚焦显微镜，Fura-2荧光显色）浓度变化特点。光镜及电镜观察注射前后的形态学变化。应用TUNAL法检测神经元的凋亡情况（3）GDNF（胶质源性神经生长因子）的脑内多点立体定向注射增加转运体的表达（up regulation）致缺血后痫性发作的变化的实验研究GDNF（胶质源性神经生长因子）的脑内多点立体定向注射，一周后，大鼠分为全脑缺血组及局灶性脑缺血组和对照组。应用western blot及免疫细胞化学的方法检测上述模型中海马及前脑酸转运体GLT-1及EAAC1的表达及分布的影响。（4）对比两种谷氨酸转运体在转运及逆向转运胞外间隙兴奋性氨基酸的作用及与缺血后痫性发作的关系。（5）统计学处理采用多组方差分析。方案：Long-Evans大鼠，随机分为2组：全脑缺血诱发声源性癫痫组及局灶性脑缺血诱发痫性发作组。每组又分为：反义寡核苷酸侧脑室注射降低转运体的表达致缺血后痫性发作的变化组，GDNF（胶质源性神经生长因子）的脑内多点立体定向注射增加转运体的表达（up regulation）致缺血后痫性发作的变化组及对照组。并将其分为缺血前及缺血后1小时，2小时，6小时，24小时，48小时，72