胃蛋白酶Word文档下载推荐.docx

1、取续滤液备用。另取试管2支,各精密加入血红蛋白试液5 mL。置（370.5）水浴中保温10 min,再精密加入5%三氯醋酸溶液5 mL。其中1支加供试品溶液1 mL,另1支加盐酸溶液1 mL,摇匀,滤过。取续滤液,分别作为供试品和对照品的空白对照,照分光光度法,在275 nm波长处测定吸收度,见图1,图2。算出平均值A s和A,按下式计算:式中,As为对照品的平均吸收度;A为供试品的平均吸收度;Ws为对照品溶液每1 mL中含酪氨酸对照品的量g;n为供试品稀释倍数。在上述条件下,每分钟能催化水解血红蛋白生成1moL酪氨酸的酶量,为一个蛋白酶活力单位。2.2干扰试验按照处方配制无胃蛋白酶的空白样品

2、,取适量,按2.1项下方法操作,结果在275 nm波长处几乎无吸收,说明处方中其他组分对胃蛋白酶活力的测定无干扰。2.3线性试验精密称取经105干燥至恒重的酪氨酸对照品85 mg,加上述盐酸溶液溶解并稀释至100 mL。再精密量取0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL各3份分别置试管中,依次加上述盐酸溶液至1.0 mL,按2.1项下方法操作,测得吸收度A值分别为:0.1383,0.2536,0.3757,0.4905,0.6111,线性回归方程为:Y=0.5912X+0.01909（r=0.9999）,线性范围为:0.170.85 gL-1,说明本方法具有良好的线性关系。2.4 回收试验

3、按处方制备高、中、低各3份共9份模拟样品,按2.1项下方法分别测定回收率,平均回收率为101.6%,结果见表12.5稳定性试验取供试液1份,室温放置,按2.1项下方法分别于0,1,3,5,8 h测定,结果测得吸收度分别为0.3926,0.3701,0.3749,0.3745,0.3704,平均吸收度为0.3765,RSD为2.46%,表明供试液在8 h内稳定性良好。2.6重复性试验取本品45粒,将内容物中的粉红色胃蛋白酶糖衣片共45片,精密称定,置研钵中,研磨均匀。精密称取适量,制备7份供试液,分别按2.1项下方法测定胃蛋白酶活力,测定结果见表2。结果表明本方法的重复性良好。表2重复性试验结果

4、二：张耀庭 ,李 娟 ,吉海滨等.应用分光光度法测定胃蛋白酶活力J.1998,11（4）:196.2.1 对照品（酪氨酸）、样品（胃蛋白酶）、底物（牛血红蛋白）溶液均按CP90方法配制。对照液浓度为500陀/以，样品稀释倍数为40000，底物浓度为1%。分别取对照液，样品溶液各1耐，置37士0.5水浴中，保温5而n，精密加人预热至37士0.5的血红蛋白试液srril，摇匀，立即计时，在37士0.5C水浴中反应10nlin，立即精密加人5%三氯醋酸5司，摇匀，滤清，在275nm处测定吸收度（同时分别做空白对照）。活力按CP90方法的公式计算即得。2.2 对6批样品进行测定，该法重现性好，测定值的

5、变异系数均在5.0%以下。取一批胃蛋白酶，在上述分光法测定条件下，在终止酶促反应后，间隔不同时间观察吸收度的变化值，测得结果表明，4h内测定活力基本稳定，略有上升，但对结果影响不大。对n批胃蛋白酶分别用不发光法和蛋清法同时进行测定，以分光法活力X对蛋清法活力Y进行线性回归，得回归方程为:Y=2080+2.77X，r=0.9904，P0.01。三：井春梅，史丽敏，王晓华.凝乳法测胃蛋白酶合剂活力的评价J. 1993，10（2）：28-29.蛋白酶的活力测定精密称取胃蛋白酶约2g，置100ml容量瓶内，加稀HCI至刻度，再将其稀释100倍作为样品液，按中国药典1990版胃蛋白酶活力测定法测得结果:

6、每1g胃蛋白酶的蛋白消化力为1730活力单位。2.3胃受白醉合荆的活力侧定将自配的胃蛋白酶合剂用稀盐酸（pH1.50）稀释100倍作为样品液，按1990版中国药典中的方法测定酶活力，同时再按中国医院制剂规范中的凝乳法测其凝乳时间，成人胃酶的测定结果见表1，表2，小儿胃酶见表3，表4。以上实验是在室温29士1下进行的，为了进一步了解温度对其效期的影响，我们又单用牛血红蛋白分光光度法在室温21士1下做了一组实验，结果见表5。通过牛血红蛋白法和凝乳法对胃酶合剂活力测定的比较，我们发现两者测定结果不一致。随着放置时间的延长，牛血红蛋白法的酶活力单位数下降很快，而相应的凝乳法随时间下降的幅度小。而且当牛

7、血红蛋白法的胃酶活力单位数降至低限以下（1200u）时，凝乳法的时间仍然符合规定（305）。相比之下，我们认为凝乳法不能很好地反应出胃酶活力的变化。牛血红蛋白分光光度法在严格控制酶促反应的条件下，即pH在1.50，温度37士。5，反应时间为10min，测定结果重现性好，而且该方法快速，灵敏，供试液稳定，能真实地反应出酶活力的变化情况。四: 刘瑜明.简介胃蛋白酶活力测定各种方法J.:47-50.1.凝固卵蛋白测定法其原理是用磨碎的卵蛋白为底物用消化凝固卵蛋白的倍数来测胃蛋白酶的活力，依据胃蛋白酶最适的温度为休温倩况下，最高不超过52。最适的酸碱度PH1.2一1.5之间（以1.4最佳）。并加少量的

8、氯化钠为激活剂，在恒温水浴中进行消化后，测定未被消化蛋白的限度，在限度以下（未消化的蛋白）为合格。此乃限度检测法，此法优点是与生理活性相符合，操作与计算简单易行，专属性高，并可同时测定很多批号的胃酶。缺点是此方法是古老经典的检测方法，只停留在限度实验水平上。由于鸡蛋来源不一，新鲜度不同，甚至同一只鸡在一周之内所产生的蛋也不同，对测定结果也有影响，以一周内产生的蛋，以蛋白干固物方法测定，最高为15.81%，最低为10.02%，说明了即便是同一只鸡，鸡蛋的蛋白也是有差异的。用此方法来控制胃蛋白酶效价，使产品在负责期内不变，重现性合格，只有增加保险系数的方法，如把1:3000倍的胃蛋白酶，控制在1:

9、3500倍以上，才能保证效价。2.以胃酶标准品作对照的凝固卵蛋白法此种方法虽然克服了鸡蛋卵蛋白的影响，但是由于胃酶纯度的影响，标准品也是胃酶，胃酶是属蛋白质范畴，若用胃酶作对照其变性问题应考虑，曾对胃酶效价动力学变化进行过探讨，刚生产出来的胃酶（原酶），效价不稳定，必须有个稳定过程，一般前六个月放置后其效价日趋下降，待六个月后才稳定平衡。因之胃酶标准品（对照品）的生产，应考虑到胃酶的工艺，纯度，稳定性之间的关系，加以探讨后才能使用，否则标准品不稳定。3.干蛋白法为克服新鲜鸡蛋的卵蛋白之间的差异，曾设想改为干蛋白为底物的测定法，通过实验，证明此法重现性更差.由于卵蛋白中含有少量的葡萄搪，制成的干

10、蛋白片后，逐渐发生褐变，据报导，过去蛋白行业制造干蛋白片是沿用自然发酵的方法除去其中的葡萄雄，但产品发臭，后又改用葡萄糖氧化酶方法，使蛋清肠翻，由于干蛋白片加工处理工艺的不同，加之翻份的新鲜度不同，对胃酶效价测定的影响，尚需进一步探讨。4.血红蛋白为底物的福林试剂比色法德国药典（1978年）已收载，我国药典（1985年）经过改进已列入含糖胃蛋白酶的测定。其原理是利用福林试剂中的钥酸钠，钨酸钠，在实验条件下可与被胃蛋白酶水解血红蛋白产生的可溶于三氯醋酸的水解产物为酪氨酸及色氨酸作用使福林试剂还原成磷钥兰和磷钨兰，溶液由黄色变为兰紫色，其颜色的深浅与胃蛋白酶活性成线性关系。然后用酪氨酸为标准进行对

11、照，计算胃蛋白酶的活力单位并作空白试验。此法优点是操作时间比卵蛋白法迅速。由于牛血红蛋白为干蛋白粉，较鸡蛋容易保存，价廉易得，比停留于限度测定有进步。缺点是我国有的单位实验室没有恒温设备，室温夏冬季悬殊，带来误差较大，又由于血红蛋白一般含有12.77%精氨酸的低分子蛋白质，所含的各种成分及纯度有差异，影响胃蛋白酶活力测定结果的准确性。所以血红蛋白应该考虑生产厂家与批号之间的差异，现介绍德国产牛红血蛋白与国产牛血红蛋白同时测定几批1:3000倍胃蛋白酶的结果。见表1。活力单位表示法（u/g）:用血红蛋白为底物在实验条件下，37每分钟催化血红蛋白，其水解产物在58Onm波长处产生与1个微克分子（1

12、协mol）酪氨酸相同的吸收度为1个胃蛋白酶活力单位（u/g）。从以上结果看，血红蛋白来源不同，对测得数据是有影响的。另外也应考虑血红蛋白的变性对测定胃蛋白酶的活力影响，由于血红蛋白也是属于蛋白质之一，所以也存在蛋白质的变性问题，变性后的蛋白质溶解度降低，对测定胃蛋白酶活力亦有影响。用此方法测定胃蛋白酶的效价，要求范围较宽，德国药典允许有25%的差异范围，说明此法不应和化学测定法一样要求那么高。目前国内胃蛋白酶的生产质量不断提高，有的厂用卵蛋白表示法巳达到1:20000倍，若用血红蛋白为底物福林试剂法测定必须予算出应加入的酶浓度的量。据周有源氏在药物分析杂志，“胃蛋白酶活力测定法测试条件探讨”一

13、文中已有数据可查，胃蛋白酶加入量在0.2一o.6mg时，酶促反应速度（初速度）与其浓度成线性关系，加入量超过。6mg后，其速度增加较慢，随后表现出不规则，而且误差大，在1.2一2.omg部分尤为突出，故在实验中不能任意改变酶浓度。我们在实验中也发现此点，据此，为了使此方法也适用于原酶（高倍数）的测定曾作出系列实验，我们实验结果1:3000倍卵蛋白相当于血红蛋白560一750u/g（德国牛血红蛋白为底物），其中间值为655u/g）所以lu/g胃蛋白酶之4.58克卵蛋白。可用稀释倍数来控制胃酶的量，如取原酶0.1g，加酸溶液稀释至200毫升，再取出10毫升稀释至100毫升。这些步骤可相同，所不同的

14、是操作取用量，例如1:1400川合则应取酶溶液体积为1x30八选=2.14ml，酸液体积补足总量4ml即可。在胃蛋白酶浓度不变的条件下，血红蛋白的用量达到100mg以上时，再增加其浓度，则反应速度趋于恒定，所以只要改变酶溶液的取用量而不受底物浓度的影响，这样可以保证足够的底物浓度，可充分发挥酶的催化作用。酶和底物之间应保持一定的比例。5.血红蛋白为底物的紫外分光光度法原理是胃蛋自酶在实验条件下，在37每分钟催化血红蛋白，其水解产物在280nm波长处，产生与l个微克分子酪氨酸相同的吸收度，为紫外分光光度法的1个胃蛋白酶活力单位。此法优于福林试剂的比色法就是可免去配制试剂的麻烦，操作更简单，但测得

15、的效价范围应作进一步探讨，见表2。6、酪蛋白为底物的福林试剂比色法日本药典第十版已采用，参考了血红蛋白为底物福林试剂比色法。其原理与血红蛋白为底物的福林试剂比色法相同，经过二种方法检测比较，配制酪蛋白溶液需要70加温溶解，比血红蛋白溶解费时间，而且血红蛋白与酪蛋白二者被胃蛋白酶水解速度是不同的，血红蛋白为底物的检测法酶促反应只需十分钟，而酪蛋白为底物的检测法酶促反应需要三十分钟，由于用试剂不同操作速度延长了二倍左右，从实验结果上看血红蛋白的吸收度是酪蛋白的二倍左右，再者酪蛋白试剂在碱性条件下溶解度较大，而胃蛋白酶是在酸性条件下活力大，血红蛋白的水解条件与胃蛋白酶是一致的，从以上几方面情况分析，

16、血红蛋白为底物福林试剂比色法应用在测定胃蛋白酶效价方面是优于酪蛋白为底物的福林试剂比色法。两种方法测定实验数据见表3。7、酪蛋白为底物的紫外分光光度法原理是在实验条件下，在37每分钟催化酪蛋白，其水解产物在28onm波长处，产生1个微克分子酪氨酸相同的吸收度，为紫外分光光度法的1个胃蛋白酶活力单位。此方法优点较酪蛋白为底物的福林试剂比色法，操作简单，并免去配福林试剂的麻烦，据垂庆所邱安荣同志报道，胃酶消化液吸收曲线与酪氨酸标准液吸收曲线不一致，酪氨酸在275nm波长处有最大吸收，而在280nm处为一肩峰。此法尚需进一步探讨。实验结果如表4。五杨 红.胃蛋白酶活力测定1.供试品测定 取具塞试管3

17、支各精密加供试液lml，置37土0.1水浴中保温5分钟，再精密加已预热至37的血红蛋白试液5ml，立即计时，摇匀置37士0.1的水浴中准确保温10分钟，立即加5%三氯醋酸溶液5ml，摇匀，放置约5分钟，滤过，弃去初滤液，精密量取滤液3ml，置另一具塞试管中，精密加水5ml与NaOH溶液lml摇匀，室温放置20分钟。另取具塞试管1支，精密加血红蛋白试液5ml，置37水浴中，保温10分钟，精密加5%三氯醋酸溶液5ml，摇匀，再精密加供试液1ml摇匀，照上述依法操作，作为空白对照，用分光光度计在58Onm的波长处，分别测定吸收值为A1、A2及A3，并求得平均值2. 对照品测定取具塞试管3支，各精密加

18、酪氨酸对照液1ml，酸溶液2ml，水5ml与NaoH溶液lml，摇匀。在振摇下精密滴加Folin试液lml，摇匀。室温放置20分钟。另取具塞试管1支，精密加酸液3ml，水5ml与NaoH液1。0ml摇匀，在振摇下精密滴加Folin试剂lml摇匀，于室温放置20分钟，作空白对照。用分光光度计在580nm的波长处分别测定吸收度为A1了、A2及A3，并求得平均值六姜建国,张西茄.双歧尔寿冲荆中，蛋白酶活力测定及稳定性考查J.中国生化药物杂志.1998,29（2）:99-100.2.1对照品溶液的制备精密称取105C干燥至恒重的酪氨酸对照品50ms，置100ml量瓶中，加0.065mol/L盐酸液适量

19、，使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。2.2标准曲线的绘制取具塞试管6支，依次向各管加入对照品溶液0、02、04、06、0.8、1.0ml，再依次加入上述盐酸液一0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml，使总体积为1.0ml，摇匀，置37C水浴中保温10min，依次加入血红蛋白试液5.0ml.混匀，准确反应10min后，再依次加入5%三氯乙酸试液5.0ml.立即摇匀，静置15min，分别滤过，取续建液2.0ml，加入另外6支试管中，各加福林一酚试液甲液5.0ml，摇匀，静置10min，各管再加福林一酚试液乙液1.0ml，摇匀，室温放置30min后，于660nm处测定吸收度，以浓度对吸收度进行线性

20、回归，得回归方程为:A=0.0013lC+0.0062，r=0.9993由回归方程可知，酪氮酸在100500，g/ml范围内线性关系良好。2.3标准液交样品液的制备精密称取羊胃粘膜提取物精制品约0.159.置于100ml量瓶中，用盐酸液（0.065mol/L）稀释至刻度，摇匀，精密吸取5.0ml，置于2个50ml的量瓶中.一份用上述盐酸液稀释至刻度，摇匀，作为标准液;另一份按处方比例加入双歧尔寿冲剂中其它各种药及辅料，然后用上述盐酸液稀释至刻度，摇匀，作为样品液。2.4标准管液的制备取具塞试管4支，各管均加入血红蛋白试液5.0ml，于37恒温水浴中保温10min，空白管内加5%三氯乙酸液5.0

21、ml，混匀，各管再精密加入标准液1.0ml，立即混匀.准确反应10min，除空白管外，再各加5%三氯乙酸液5.0ml.立即混匀，静置15min，分别滤过，滤液即为标准管液。2.5样品管液的制备在制备标准管液的同时，另取具塞试管7支，各加入血红蛋白试液5.0ml，于37C恒温水浴中保温10min.空白管加入5%三抓乙酸液5.oml，混匀，各管再精密加样品液1.oml，余同2.4项，滤液即为样品管液。2.6回收率实脸分别精密量取标准管液和样品管液2.0ml，置另外11支试管中，各加福林一酚试液甲液5.0ml.混匀，静置10min，再各加福林一酚试液乙液1.0ml混匀，室沮放置30min后.于紫外分光光度计上在660nm波长处，以上述空白盐酸液作空白，分别测定标准管液和样品管液的吸收度，按下式计算6份样品管液的回收率。计算得平均回收率为100.27%，RSD为1.41%（n=6）。2.7样品浏定取双歧尔寿冲剂5批，每批取样品5袋，研细，精密称取约0.39，分别置50ml量瓶，用上述盐酸液稀释至刻度，用时摇匀。取具塞试管7支，以下操作同回收率试验，在37C，每分钟催化生成l眼酪氨酸的量为1个酶活力单位.测得5批样品的胃蛋白酶活力见表l。2.8样品德定性考查取样品三批，室温避光放置，分别于0、l、2、3、6、12、18个月测定样品的蛋白酶活力，结果见表2。