普瑞巴林对癫痫模型大鼠神经元的保护作用及其机制文档格式.docx

1、同时，与对照组相比，癫痫组和 Pregabalin 3个剂量组大鼠 CA1区蛋白表达强度升高（P0.05）;与癫痫组相比， Pregabalin 3个剂量组大鼠CA1区蛋白表达强度降低（P0.05）。结论 Pregabalin对PTZ诱导的癫痫大鼠的发作有明显的对抗作用，癫痫 大鼠海马具有保护作用，其作用与P38MAPK通路相关蛋白的表达相 关。【关键词】 癫痫;普瑞巴林；痫性发作;皮层脑电图Pregabali n s In flue nee on Experime nt Rats of Caused EpilepsyZHU Jin Ii1 ， LIU Xuewe n2（1 丄 ia onin

2、g MedicalUniversity;2.The First Affiliated Hospital of Liaoning MedicalUniversity, Jinzhou 121001 China）Abstract: Objective To explore the effect of GABA receptor blocker Pregabalin to epilepsy rats induced by Pentylentetrazol role model. Methods 38 healthy SD rats were ran domly divided into 5 grou

3、ps, con trol group, epilepsy group and 3 different dose Pregabalin group （20,40,80 mg/kg）. Observe seizures situatio n of Rats before and after in traperit on eal injection, while recording cortical EEG （electrocoti cogram, ECoG）.To analyse the expression of P38MAPK hippocampus area CA1, P38MAPK and

4、 upstream MKK3, downstream of MYC-related protein useing Western blot electrophoretic methods. Results Control group all have seizure emerged after PTZ, the degree of attack significantly reduced in the pregabalin group. Incubation period of ECoG extended, the duration of one hour epileptiform disch

5、arges shorted. At the same time, compared with the control group, inten sity of protein expressi on in CA1 area of rats in creased in epilepsy group and 3 doses Pregabali n groups （P0.05）.Compared with the epilepsy group, intensity of protein expression in CA1 area of rats decreased in 3 doses Prega

6、balin groups （P0.05）. Con clusi ons Pregabali n has the obvious oppos ing reaction to the PTZ-induced epileptic seizures in rats and the protective function to seahorse of the epileptic rat. This function is related to the expressi on of pathway-associated prote in.Key words:epilesy; Pregabalin; epi

7、leptic seizure; electrocoti cogram癫痫是以脑部神经元过度放电所致的突然发生的短暂的中枢神 经系统功能失常为特征，表现运动、感觉、行为、自主神经等的不同障 碍。Y氨基丁酸（Yami no butyric acid, GABA）是中枢神经系统主要的 抑制性神经递质，通过位于脑内的 GABA受体发挥抑制性作用，在抗癫痫上起重要作用。大量动物实验证实普瑞巴林 （Pregabalin）是一种有效的GABA受体的激动剂1，据此我们推测Pregabalin可能具 有抗癫痫作用。本研究应用戊四唑（Pe ntyle ntetrazol, PTZ）快速诱导 大鼠癫痫模型，通过行为

8、学观察和脑电图记录研究 Pregabalin的抗癫痫作用。并探讨Pregabalin对P38MAPK信号及其上、下游通路 的作用。1材料和方法1.1试剂及仪器Pregabalin ：武汉远城科技发展有限公司，PTZ :美国Sigma 公司生产，P38MAKP抗体、c-Myc抗体:武汉博士德生物工程有限公 司;MKK3抗体：天津赛尔生物技术有限公司 ；大鼠脑立体定位仪：VDT-1西北光学仪器厂。1.2方法健康Sprague-Dawley 大鼠38只，雌雄各半，体重210220g（辽宁医学院动物中心提供），单笼饲养，随机分组，对照组 6只， 余每组8只。大鼠麻醉后将其固定与脑立体定位仪上，切开头皮

9、， 暴露颅骨，在前囟后7.0 mm、正中缝旁开3.0 mm、硬膜下0.5 mm， 即左右顶叶皮质，用牙科水泥固定两个螺丝，其尾端分别引出一不锈 钢电极，选择前额正中为0电极，分别与前述两电极相连，组成单导 联，待测皮质脑电图（ECoG）。将动物随机分为5组，即对照组、癫 痫组和Pregabalin 3个剂量组（20、40、80 mg/kg）。均固定电极， 第二天对照组腹腔注射生理盐水 20 min后腹腔注射 PTZ（65mg/kg），癫痫组腹腔注射 PTZ（65 mg/kg）和Pregabalin 3 个剂量组 （按三个不同剂量）分别腹腔注射 Pregabalin 20 min后腹腔注射PTZ

10、（65 mg/kg）。观察大鼠癫痫发作的情况及 EcoG的改变。用Pclab 生物信号处理系统进行采集，低速25 mm/s，当出现频发棘波或尖波， 棘慢、尖慢复合波，阵发性高波幅时，判定为脑电图癫痫样放电活动， 观察癫痫样放电的潜伏期，并分别连续记录腹腔注射 PTZ后1小时内累积癫痫样放电活动持续时间。癫痫发作分级参照acine分级标准 2。1.3 Western blot 检测 P38MAPK 表达急性癫痫大鼠模型制备后2小时，每组随机抽取半数大鼠，取出海马-70 C冰存，经转膜一洗膜一封闭一一抗反应一二抗反应一洗膜显色后用发光法进行 X光胶片曝光。然后进行条带扫描和分析P38MAPK及其上

11、游MKK3，下游c-MYC相关蛋白的表达。1.4统计学方法实验结果计量资料均用士 s表示，统计分析采用F检验及q检验。 P0.05作为差异显著性指标，P0.01为差异极显著性指标。2结果2.1Pregabalin对PTZ致痫大鼠的痫性行为的影响癫痫组6只大鼠均出现痫性发作，其发作程度均为5 级;Pregabalin 20 mg/kg组，8只大鼠均出现癫痫发作，但程度较对 照组明显减轻，其中2只3级发作，3只2级发作，3只1级发 作;Pregabalin 40 mg/kg 组，8只大鼠1只未发作，4只1级发作， 3只2级发作;Pregabalin 80 mg/kg 组，6只1级发作，2只2级 发

12、作。2.2Pregabalin 对PTZ致痫大鼠的ECoG的影响正常大鼠ECoG均以a、B波为主要表现，无明显节律性，波幅 4070凶，癫痫组观察的6只大鼠均在给药后很快出现癫痫样放 电，潜伏期为（1.41 0.37）min，表现为棘波、棘-慢波，波幅高达200 凶，且癫痫样放电反复出现，1小时内累计持续时间（27.46 1.13） min，普瑞巴林20 mg/kg组，观察8只大鼠中均出现癫痫样放电， 但潜伏期明显延长，为（6.04 0.83） min，同PTZ组比较有显著性差 异（P0.05）。1小时持续时间缩短，为（21.81 2.06） min，波幅150卩V，同PTZ比较未达到显著性差

13、异（P0.05）。普瑞巴林40 mg/kg组及普瑞巴林80 mg/kg组，潜伏期进一步延长，分别为（9.82 1.91） min 和（12.35 3.74） min，1小时持续时间进一步缩短，分别为 （18.44 1.91） min和（16.67 1.19） min，同对照组比较具有显著性差异， 波幅也明显降低，见表1。表1 Pregabalin对PTZ诱导的癫痫大鼠ECoG 的影响同PTZ组比较，P0.052.3 Pregabalin对PTZ诱导的癫痫大鼠脑组织 MKK3、P38MAPK、c-MYC蛋白表达的影响Western blot结果显示，与对照组比较， PTZ 组的 MKK3、P38

14、MAPK、c-MYC蛋白表达明显增加 （P0.01）;与PTZ组比较， Pregabalin 组的 MKK3、P38MAPK、c-MYC 蛋白表达降低（P0.05）， 见表 2 和图 1。表 2 Western blot MKK3、P38MAPK、c-MYC 表达 灰度值注：与PTZ组比较，*P 0.05;与对照组比较，P0.01图1 MKK3、 P38MAPK、C-MYC的蛋白印记3讨论癫痫发作的病理生理学基础是各种原因导致的脑神经元异常放 电，脑电图是诊断癫痫的最基本、最重要的检查方法。为探讨其发病 机制和寻找有效的治疗药物，可通过建立癫痫动物模型，观察行为学 的异常，脑电图的改变，兴奋性

15、神经递质的测定，病理学的观察来达 到目的。本实验观察了 Pregabalin对PTZ导的急性癫痫模型的抗癫 痫作用。Pregabalin化学名为（3S）-3-氨甲基-5-甲基己酸3，是GABA 受体的拮抗剂，普瑞巴林是神经递质GABA的一种类似物，能阻断电 压依赖性钙通道，减少神经递质的释放。可与中枢神经系统中电压门 控钙通道辅助性亚单位（必-3蛋白）结合而表现出较高的抗癫痫、止痛 和抗焦虑活性。本实验拟从 GABA是中枢神经系统的主要抑制剂4 的角度出发探讨Pregabalin的抗癫痫的作用及其机制。GABA是中枢神经系统主要的抑制性神经递质，通过位于脑内 的GABA受体发挥抑制性作用，中枢

16、神经系统 GABA含量降低是神 经细胞过度兴奋、诱导同步放电、导致癫痫发作的重要原因之 一;GABA是脑内含量较高的重要抑制性神经递质。实验上和理论上 都有证据表明GABA能神经传递是神经同步活动的基础。在一些环 境中，GABA介导的电位可被去极化，继而引起神经兴奋。 FujiwaraTsukamoto等发现，兴奋性 GABA中间神经元和锥体细胞间的谷氨 酸回返连接形成正反馈回路，发生同步的癫痫后放电活动。还发现在 成年鼠海马CA1区，兴奋性GABA参与癫痫的节律性同步活动，高 频的突触刺激可诱发发作后放电。 在大鼠海马切片中发现，选择性离 子移变拮抗剂谷氨酸受体或 GABA受体和缝隙连接抑制

17、剂完全阻断 海马后放电活动。GABAA受体是脑内最普遍的抑制性递质受体，与 癫痢的关系最密切。GABAA受体是神经细胞内最常见的抑制性神经 递质，是一种配体门控的氯离子通道。 GABAA受体激活后打开氯离子通道增加神经元细胞膜 Cl-通透性，导致Cl-通道开放，大量Cl-快 速内流引起突触后膜超极化，阻抑调控神经元过度放电及突触后易 化，产生抑制性突触后电位发挥突触后抑制作用。癫痫发病机制极为复杂，有钙离子、兴奋性氨基酸及多条信号 转导通路参与5。其中，MAPK信号通路是目前研究的热点。MAPK 信号途径包括 ERK1/2p38MAPK、JNK和ERK5 4个成分，是多种 细胞外信号引起核反应

18、的细胞内汇聚通路， 广泛参与细胞生长、分化、 死亡等。近年来MAPK与癫痫的关系越来越受到重视，MAPK的激活在 发作急性期癫痫持续状态、慢性癫痫中都有报道。有学者认为 ERK/MAPK途径的激活也是诱导和维持反应性胶质增生的必由之 路，并在包括慢性癫痫、脑梗死等的慢性损伤脑组织中检测到 ERK/MAPK免疫反应强阳性7。以往的多种点燃模型中都发现了癫 痫大鼠海马透明层的p38MAPK含量增加，本研究与以上结果一致。本研究结果显示，PTZ诱导的癫痫大鼠p38MAPK蛋白表达增 高，信号转导通路被激活，而Pregabalin预处理后，p38MAPK表达 减少，且随着Pregabalin的剂量增加

19、p38MAPK表达逐渐减少，呈 现剂量依赖性保护效应，提示 p38MAPK通路参与了 PTZ诱导的癫 痫大鼠发作后的病理过程，GABA受体的阻滞剂Pregabalin可抑制 其表达。总之，由此可以看出 Pregabalin具有明显的抗癫痫作用， p38MAPK在癫痫后神经元损伤中扮演的角色及其与其他信号通路之 间联系意义重大，它将为癫痫的治疗开辟新的视角和调控位点。【参考文献】1陈敖,张建军.新药普瑞巴林的合成J.精细与专用化学品，2005，13（10）:14-17.2Racine RJ. Modification of Seizure activety by electrical stimu

20、lation:II.Motors seizure. Electroencephalogr clin Neurophysiol,1972,32（3）:281-294.3张桂森，杨相平,刘笔锋.普瑞巴林的合成J.中国医药 工业杂志,2007, 38（9）:617-619.4张新定，裘明德.氨基丁酸系统与癫痫J.兰州大学学报（医学版）,2006, 93 （4）:93-96.5Jia ng Y,Gram H,Zhao M,et al.Characterizatio n of the structure and fun cti on of the fourth member of p38 group m

21、itoge n activated protein kin ase p38 deltaJ. J Biol Chem,1997,272（48）:30122-30128.6Harris on JC,Zyla TR.S ress specific activatio n mechanisms for the “cell integrity ” MAPK pathwayJ.Biol Chem,2004,279（4）:2616.7Zhu Y,Culmsee C,Klumpp S,et al.Neuroprotection by transforming growth factor-beta l invoIves activation of nuclearfactor-kappa B through phosphatidylinositol-3-OH kinase/Akt andmitogen-activated protein kinase- extracellular-signalkin asel, 2regulatedsig nali ngpathwaysJ.Neuroscie nce,2004,123（4）:897-906.