简述细菌外膜在糖代谢中的作用Word文件下载.docx

1、相对于高等生物，细菌的细胞结构简单，生长和繁殖周期短，大量同种群的细胞极易收集，而且更重要的是，细菌基因组很小，容易测定，并且它们的基因组结构相对简单，对其注释也较为容易。所以它被人们广泛采用进行细胞膜的物质转运机理的研究。正是由于以上原因，人们已经对大肠埃希氏菌（Escherichia coli），鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium），以及枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的一些转运系统进行了深入研究。迄今为止，人们已经在细菌外膜上发现了五种载体介导的糖类转运机理。而且每一种类型都存在于大肠埃希氏菌（Escherichia coli）中。其原理图示可

2、见图2。根据物质转运所需能量的来源，我们可以方便的将它们进行分门别类。（1） 易化扩散，此运输不需要代谢能量，物质顺着浓度梯度进入细胞。丙三醇的跨膜运输便是采用这种方式。（2） 其他转运系统则通过耗费能量逆着浓度梯度运输物质，所以被称作主动运输系统。主动运输系统能够在细胞膜的一端富集底物是由于载体在转运物质从细胞膜的一端到达另一端时发生了构象的改变。促使载体构象改变的能量来自细胞代谢产生的特异产物，人们正是根据代谢能量的来源而将这些主动运输系统进行归类。目前人们在大肠埃希氏菌（Escherichia coli），鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）所发现的糖类主动转运

3、系统有（1）麦芽糖转运系统，它利用细胞的化学能在胞内富集所需的底物；（2） 乳糖通透酶，利用质子的电化学梯度作为能量进行物质运输；（3） 蜜二糖通透酶，通过Na+-糖协同运输行使功能；（4） 磷酸转移酶系（phosphotransferase system，PTS），底物葡萄糖先被磷酸化再转移进入细胞。该转运机制又叫基团易位。已有相关文献对该转运术语进行了详细描述。图2. 载体介导的糖类运输机制Fig. 2. Carrier-mediated transport mechanisms.Representative examples （in parentheses） occur in E.col

4、i. Abbreviations: GLYC, glycerol; MAL, maltose; LAC, lactose; MEL, melibiose; GLC, glucose; G-6-P, glucose 6-phosphate; PEP, phosphoenolpyruvate; D+ Pi, nonphosphorylated donor plus inorganic phosphate; D - P, high-energy phosphorylated donor; I, enzyme I; II, enzyme II; III, enzyme III.2.1 易化扩散该类型转

5、运系统催化易化扩散，最终导致底物在细胞膜内外的浓度平衡。由于转运过程不需要代谢能量，所以底物不会在细胞内高度富集。甘油（丙三醇）是目前为止唯一一种通过易化扩散转运至细菌胞内的糖类。LIN对大肠杆菌摄入和利用丙三醇的过程作了详尽的描述。现将其概述如下。2.1.1 大肠埃希氏菌的丙三醇转运系统长期以来，人们发现细菌在高浓度的甘油溶液里并不会发生质壁分离现象。这似乎提示甘油可以快速地在细胞膜两侧实现浓度平衡。甘油也许通过自由扩散进入细胞，但是人们无法知道细胞是否可以在低浓度的溶液中以被动的机制有效摄入甘油。1965年，Hayashi和Lin发现缺失了甘油激酶（大肠埃希氏菌利用甘油的第一个酶）的大肠埃

6、希氏菌K-12的变异株无法在胞内富集14C标记的甘油。而具备正常甘油激酶活性但丧失L-甘油磷酸脱氢酶活性的突变株在胞内富集大量标记的L-甘油磷酸，甘油激酶与其底物反应的Km值与正常菌株摄入甘油底物的Km值相当。这些现象表明，甘油能在胞内富集的原因在于甘油激酶对甘油的诱捕作用。Sanno等人经过比较检测大肠埃希氏菌生长在甘油环境中和正常环境中的渗透效应，找到了相应转运蛋白存在的证据。当他们向葡萄糖培养基生长的细菌加入高渗的甘油溶液时，细胞悬液的光密度急剧上升，细菌发生质壁分离；而后悬液光密度值又开始降低，细胞慢慢恢复正常形态。细菌在加入甘油培养基里的生长大大加快了它们形态恢复的速度。该迹象表明，

7、甘油诱导了特异易化子的表达。甘油对甘油激酶的阴性突变株无法发生诱导作用。而在NaCl溶液的对照实验中，发现它对大肠埃希氏菌的葡萄糖培养组和甘油培养组之间的质壁分离缓解程度没有差异。进一步研究发现，编码转运蛋白的基因（glpF）和编码甘油激酶的基因（glpK）作图大概位于大肠埃希氏菌染色体图谱的87min区域。该反应途径其他酶的编码基因则位于该染色体的其他区域，但是上述所有基因似乎都受到基因glpR（位于染色体的74min区域）产物的消极调控。他们估计蛋白glpR结合L-甘油磷酸形成新的化合物，并产生诱导作用。2.1.2 其他细菌的易化扩散系统甘油的易化扩散系统广泛存在于其他的细菌，除了大肠埃希

8、氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，甘油转运蛋白还存在于假单胞菌、克雷白氏杆菌、志贺氏杆菌和诺卡氏菌。实际上，人们在对上述细菌的研究中，均发现甘油经过易化扩散进入胞浆的现象。甘油极易溶于脂双层细胞膜中，转运蛋白可以最大限度将其传输至甘油激酶。目前关于糖类易化扩散的唯一一个特例报道是Button等人的研究结果，他们发现麦芽糖进入葡萄球菌与磷酸烯醇式丙酮酸盐磷酸化路径（基团易位）并无关联性，而是一个自由扩散过程。2.2 渗压休克敏感性主动运输革兰氏阴性细菌的休克敏感运输系统对糖类的摄取活动取决于细胞质中糖类结合蛋白的实际浓度，其活性随着结合蛋白的降低而减弱。迄今发现，该类运输系统都是利用代谢产生的化学能进行胞内

9、物质的富集。经证实，大肠埃希氏菌和鼠伤寒沙门氏菌都含有大量的渗压休克敏感性主动运输系统，用于糖类和氨基酸的转运（见表1）。表1以大肠埃希氏菌的麦芽糖运输为例说明了休克敏感性运输系统的工作特点。表1. 大肠埃希氏菌中的休克敏感性糖类运输系统TABLE 1. Shock-sensitive carbohydrate transport systems in E. colia ND, Not determined.2.2.1 大肠埃希氏菌的麦芽糖运输系统麦芽糖结合蛋白是一个分子量为37kDa的单一多肽链。麦芽糖及麦芽糖糊精转运系统的5个编码基因位于大肠埃希氏菌染色体的malB区域。目前已经成功鉴定了

10、其中3个基因的表达产物，它们分别是，（1） malE基因，编码胞质麦芽糖结合蛋白的结构基因；（2） 基因lamB，编码细胞外膜孔道蛋白，协助易化麦芽糊精的跨膜运输。（3） 基因malF的表达产物是细胞质膜蛋白。其余两个基因malK 和malG的表达产物尚未得到鉴定。基因malB的调节子大约位于大肠埃希氏菌（E.coli）染色体的90min区域，细菌在麦芽糖生长环境中，麦芽糖结合蛋白及其转运被诱导活性提高10倍以上，同时它们的活性又受到基因malT突变株的抑制。基因malT位于基因malA区域的74min，它是malPQ 操纵子（编码麦芽糖分解酶）以及malB区域两个操纵子的共同调节基因。休克敏

11、感性转运系统是初级主动运输系统，它对底物的运输直接与化学能相偶联。目前发现的所有休克敏感性运输系统均具有这个特点。人们发现了如下的实验现象与麦芽糖转运的能量偶联相关。（1） 氧化磷酸化作用的解偶联剂（二硝基酚，叠氮化物等）只能部分抑制胞内麦芽糖的堆积，而果糖比D-乳糖更易于刺激三磷酸腺苷酶（ATPase）的阴性突变株加大对麦芽糖的摄取量；（2） 细菌对麦芽糖的摄入受砷酸盐的抑制，其他的结合蛋白系统也对砷酸盐非常的敏感。上述抑制剂通过破坏细胞膜内外正常的质子和（或）离子梯度来抑制氧化磷酸化作用。因此，它们不仅破坏了化学渗透势偶联的物质转运系统，而且削弱了结合蛋白系统对底物的结合能力，进而降低胞内

12、三磷酸腺苷（ATP）的储量。然而，由于ATP在胞内的库存也可以通过底物水平磷酸化得到补充，所以初级主动运输还是照常进行。与野生菌株相比，氧化磷酸化抑制剂对缺失ATP酶突变株的初级主动运输作用效果要大大降低，它们的ATP储量大多来自于底物水平磷酸化，而对氧化磷酸化的依赖性大为减弱。这些现象正好解释了为何果糖比D-乳糖更适于作为缺失ATP酶活性突变株摄取麦芽糖的能量来源。当细菌进行糖酵解时，果糖通过底物水平磷酸化产生化学能，而D-乳糖的代谢则主要经过氧化磷酸化来获得ATP。一般而言，结合蛋白系统对砷酸盐的抑制作用非常敏感，因为该抑制剂大大削弱了ATP的胞内储量。然而，麦芽糖通道系统所受砷酸盐的抑制

13、程度却不如同类型的其他一些系统那么强烈，其原因尚不清楚。也许比起其他系统，麦芽糖通道系统对化学能源物质具有更强的亲和力。据报道，18-甲基半乳糖苷（18-methylgalactoside）依赖性结合蛋白行使功能时并未发生质子的同向转移。这似乎表明，是某个代谢物，比如ATP，而不是造成化学渗透势的能源物质，在促使麦芽糖等的主动运输系统行使运输功能。然而，上述能量偶联假说并不能轻易解释别人提出的以下两个试验现象。其一，大肠杆菌素K可以在不降低胞内ATP水平情况下，消除大肠埃希氏菌ATP酶阴性突变株的化学渗透势，但是休克敏感转运系统却受到抑制。其二，人们所分离得到的大肠埃希氏菌温度敏感突变株即使胞

14、内ATP水平提高，其初级和次级主动运输系统也都缺乏能量偶联机制。这些现象无疑让人们产生了新的假说，结合蛋白依赖性运输并非直接与化学能相偶联，而是间接地从一个代谢中间产物获取能量，而该产物是普遍存在于所有主动运输系统中的能量转换组分。有趣的是，大肠埃希氏菌的麦芽糖外排和摄取似乎并不是由同一个系统完成。麦芽糖的外排对氧化磷酸化解偶联剂的抑制敏感，而对砷酸盐的抑制却相对不敏感。化学渗透能的作用也许是在麦芽糖外排时，促使麦芽糖载体保持一个恰当的方向，也或许由于其他原因，它是细菌选择便于麦芽糖外排的方向所必需的。目前还无法确认催化麦芽糖外排的蛋白质编码基因是否位于malB区域。然而，编码-甲基半乳糖苷转

15、运系统组分的基因突变株都不会发生半乳糖苷外排的异常变化。Hong等人的研究证明了乙酰磷酸盐是结合蛋白依赖性转运系统的直接能量来源。他们利用代谢抑制剂，通过基因工程手段限制乙酰磷酸盐的合成，发现大肠埃希氏菌无法摄取结合蛋白系统的底物，除非恢复乙酰磷酸盐生物合成的正常途径。然而，由于实验条件限制，为了限制乙酰磷酸盐的产生，他们降低了胞内ATP水平。因此，仍然有可能的是，胞内其他某个需要ATP供能的合成的高能化合物充当这些运输系统的能量来源。迄今为止，人们还无法证实乙酰磷酸盐直接作用于结合蛋白依赖性运输系统并触发转运效应。2.2.1 其他休克敏感转运系统目前所发现的大肠埃希氏菌休克敏感性糖转运系统均

16、列于表1。表中所有信息均来自于两篇相关综述。有趣的是，我们发现表中罗列的多数糖类转运系统，均可以偶联于其他形式的代谢能量。这种特性也许可以赋予细菌在多种环境条件下的生存优势。2.3 质子连锁性主动运输2.3.1 化学渗透偶联原理1961年，Mitchell为了解释生物膜两侧的能量守恒提出了化学渗透偶联的假说。他认为，生物氧化产生的能量可以通过形成跨膜质子电化学势能差的形式获得储存。此后人们也证明了该势能差为细胞完成多种与膜相关的细胞活动提供了能量支持，比如氧化磷酸化，营养物质的转运。由于化学渗透偶联假说这个概念革新了人们对生物能偶联机制的研究，也因为Mitchell的出色工作，他于1978荣获

17、诺贝尔化学奖。1945年，Lundegardh提出假说，如果细胞色素系统跨膜同向排列，底物将在细胞膜一侧发生氧化并产生质子（H+），质子穿过胞膜被细胞所利用。该假说为化学渗透偶联模型的形成奠定了基础，并很好的解释了电子转运系统释放的能量是如何转化，最后形成跨膜质子浓度差并产生电势能。为了完成偶联过程，跨膜返回的质子流可能参与能量的整合过程，比如ATP的合成等。已有许多综述报道了化学渗透偶联机制的存在及其生物功能。为了维持质子梯度，细胞膜就必须拒绝氢离子和氢氧根离子的跨膜通透。1967年，Mitchell 和 Moyle 通过检测线粒体膜两侧的氢离子滴定速率证明了生物膜对上述离子不具有通透性。现

18、在人们业已知道质子的非通透性是许多生物膜和人工构建的磷脂双分子层的一个共性。化学渗透偶联运输被人们定义为二级主动运输。初级主动运输导致了质子外排（即将光能、电能、或者化学能转化成电渗透能的过程），为二级主动运输提供能量。这种能源物质与底物（如乳糖）运输偶联的现象，造成了吸能反应（营养物质的大量摄入并在胞内富集）与放能反应（质子顺着浓度梯度传递）同时并存的结果。Mitchell提出了同向转移（symport）、反向转运（antiport）和单向转运（uniport）等三个专业术语用于描述代谢物与离子运输的连锁机制。同向转移是指两种底物在同一系统中被同一个载体按相同方向进行转运。反向转运系统则是将

19、两种底物按相反方向进行易位。与前两者不同的是，单向转运是将某种底物跨膜运输但不与其他物质的运输相偶联。为了更加详尽的将这些概念进行归类讨论，我们可以参见Rosen 和 Kashket的研究结果。2.3.2 乳糖-质子同向转移（Lactose-Proton Symport）大肠埃希氏菌的乳糖透酶是第一个被人们发现的细菌跨膜运输系统。1956年，有人对其深入研究并发现该转运蛋白是由一个位于乳糖操众子区域的特别基因，lacY所编码。Mitchell首次提出，乳糖通过与质子的同向转移（Symport）并与化学能相偶联，进而在胞内富集。Mitchell课题组的初步试验数据证实了他的假说。Mitchell

20、和West发现，当甲基-硫代-8-D-吡喃型半乳糖苷（TMG，一种可被乳糖透酶转运的但无法代谢被利用的糖类似物）添加到营养缺乏的细菌时，细胞膜外的质子将大量进入细胞而打破膜内外的电化学梯度，进而导致细胞浆呈酸性，胞外的培养基碱性的结果。Collin等人的实验也证实了Mitchell等的研究结果。根据运输蛋白失活和底物竞争结合研究，有人发现乳糖通透酶有两个截然不同的糖结合位点。1965年，Fox 和 Kennedy报道，巯基试剂 N-乙基-马来酰胺（NEM）可以抑制乳糖通透酶对O-硝化苯-8-D-吡喃型半乳糖苷的转运，而硫二甘醇（TDG）又可以解除这种抑制作用。两种试剂所作用的组分就是细胞膜结合

21、的乳糖通透酶61。然而，令人惊讶的是，其他好些包括乳糖在内的乳糖通透酶底物，却无法保护该蛋白免受NEM的抑制作用。根据上述研究，人们将乳糖通透的底物分成两大类，它们是NEM抑制失活性底物和NEM抑制性底物。表2所列的就是该两大类底物的一些成员。表2. 乳糖通透酶的两大类型底物 TABLE 2. Lactose permease substrate classes表2所列的第一类底物无法保护乳糖通透酶免受NEM的抑制作用，而第二类底物则可以。蜜二糖和TDG是其中最为有效的保护型底物。Kennedy实验室通过开展多种糖类对M蛋白结合的3H-TDG 置换力比较试验，也很好区分了这两类糖类底物。总体而

22、言，人们发现第二类底物，比如蜜二糖，可以竞争置换TDG，而第一类底物至多也只有微不足道的效果。而且人们还发现，第二类底物可以抑制第一类底物与通透酶的结合，却未发现第一类底物抑制第二类底物的情况。为了解释这些实验现象，有人提出假设，乳糖通透酶具有两个底物结合位点，而且其中一个位点附近存在一个半胱氨酸残基，便于底物结合然后保护通透酶免受NEM的抑制作用。Kepes认为，正是由于两类底物对通透酶亲和力的巨大悬殊，才致使两大类底物即便在同等浓度下亦产生竞争性抑制，也决定了它们是否保护酶免受NEM的抑制作用。 Carter 等人则认为两类底物在酶上具有相同的结合位点，但一类底物的立体化学结构无法保护极具

23、化学反应活性的半胱氨酸残基。为了证实乳糖通透酶结合位点的问题，Wright等人采用细胞膜上lacY载体含量比野生型多10倍的大肠埃希氏菌突变菌株作材料，通过超声破碎和蔗糖密度梯度离心获得相应的胞膜组分，并发现该组分对第一类底物亲和力较弱，而对第二类底物则较强，亲和力弱的第二类底物，如丙三醇-8-D-半乳糖苷和异乳糖等并未结合到组分中。当高浓度的第一类底物如乳糖添加到组分中时，他们观察到了底物对酶抵抗NEM抑制的保护作用。由此，Wright的研究证实了该通透酶只有一个位点的观点，所有的底物都结合到通透酶的这个唯一位点，并保护保护其附近关键的半胱氨酸残基免遭NEM对其衍生化作用。一些遗传学研究结果

24、似乎也与酶的单一位点模型假说相一致，Langridge选择了1000例的lacY突变株进行检测，结果却并未发现任何一例是仅转运一类或二类底物的菌株。Hobson 等人也曾利用遗传学技术结果也未分离到支持双位点运输的突变菌株。Kaczorowski等人对乳糖从大肠埃希氏菌胞膜囊泡外排过程进行了较详尽的动力学研究。结果表明，乳糖的单向外排很大程度上决定于介质中的pH值，不同pH值外排速度不一样，介质pH值7.5时的速度要大于pH6.5或5.5的速度。相比之下，囊泡内外两侧饱和浓度的乳糖，对流进出囊泡的速度却要快得多（大约是单向外排的10倍）并且不受外界pH值的影响。乳糖的单向外排过程的同时伴随着膜

25、内外短暂的电势差的形成（膜内呈阴性），而这一效应可以被质子易位的解偶联剂（如羰基氰化-m-氯苯基腙等）破坏。根据上述实验和其他相关工作，Kaczorowski等人得出结论，乳糖通透酶通过载体模型机制来行使功能。在单向外排过程中，乳糖和质子同时结合在载体的胞质侧然后以一种中性复合物的形式跨膜易位到细胞外侧，先是乳糖然后是质子再从载体上释放到达外部介质当中，最后，携带负电荷的游离态载体（未结合质子和糖类的状态）再跨膜易位回到细胞膜的胞浆一侧。质子释放到外界以及（或者）游离态载体跨膜回位可能就是整个乳糖运输过程中的限速环节。而在乳糖对流进出囊泡时，整个过程并不发生去质子化，中性的载体周而复始地在膜内

26、外两侧分离乳糖-载体复合物，释放乳糖。这种假说正好解释了上述乳糖不受pH值影响快速对流运输的现象。2.4 大肠埃希氏菌（E. coLi）和伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的Na+-蜜二糖协同运送许多年前人们就知道了真核细胞摄取糖类和氨基酸的Na+协同运送系统。MacLeod及其同事首次从一株海洋假单胞菌中发现Na+协同运送系统。目前所知道的细菌糖类-Na+协同运送系统是由Stock和 Roseman于1971年提出，他们发现伤寒沙门氏菌可以通过蜜二糖诱导运输系统，而且依赖钠离子的机制运输甲基-硫代-8-D-吡喃型半乳糖苷（TMG，一种无法被细菌代谢利用的糖类似物）。

27、细菌对钠离子和TMG摄取数量比例是1：1。此后人们也在大肠埃希氏菌中发现了类似的协同运送现象。于是，人们提出了直至目前为止仍然广为接受的协同运送假说，该假说认为，由于细胞膜外钠离子浓度高，钠离子顺电化学梯度流向膜内，蜜二糖利用钠离子梯度提供的能量，经过专一性的转运载体，伴随钠离子一起运送入细胞内。钠离子浓度梯度越大，蜜二糖进入的速度也就越快。胞外钠离子浓度减少，则糖进入的速度也减慢。进入胞内的钠离子又经过钠离子泵运送到细胞外以维持正常的钠离子梯度，如此不断运送蜜二糖。2.5 基团运输一般而言，物质进入细胞时本身不需要经过化学改变，但是某些糖类经过细菌细胞膜时需要化学修饰。一个经典的例子就是19

28、64年由Kundig等人在大肠埃希氏菌中发现的磷酸烯醇式丙酮酸转磷酸化酶系统即PTS系统。基团转运系统不是利用ATP而是利用磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）作为磷酸基团供体，PEP经PTS催化转移磷酸基团使糖磷酸化并运送通过细胞膜（见图3）。图3. 大肠埃希氏菌和鼠伤风沙门氏菌糖代谢中的磷酸烯醇式丙酮酸:磷酸烯醇式丙酮酸转磷酸化酶系统FIG. 3. Phosphoenolpyruvate:sugar PTS in E. coli and S. typhimurium. Abbreviations: EI, enzyme I; EII, enzyme II; EIII, enzyme III; HPr

29、, small, histidine-containing phosphocarrier protein of the PTS; PEP, phosphoe-nolpyruvate; -P, phosphorylated compound.2.5.1 细菌转磷酸化酶（PTS）的分布细菌转磷酸化酶系统（PTS）分布广泛，表3所列的就是具有PTS系统的菌属，还列出了不同菌属的伯杰氏分组编号和已知的PTS底物。而表4所列的则是缺乏PTS活性的菌属。根据细菌对己糖和己糖醇分解途径，可以将PTS分布模式归为如下两类。（1）严格需氧菌，如固氮菌，微球菌，分支杆菌和诺卡氏菌等，没有PTS系统。专性需氧菌往往通过Entner-Doudoroff 途径（N. Pelliccione, B. Jaffin, M. E. Sob