超声联合微泡对内皮祖细胞体外增殖凋亡及细胞周期的阻碍.docx

1、超声联合微泡对内皮祖细胞体外增殖凋亡及细胞周期的阻碍超声联合微泡对内皮祖细胞体外增殖、凋亡及细胞周期的阻碍 范国峰，冯毅，童嘉毅，杨芳，马根山，姚玉宇【摘要】 目的：体外探讨超声联合微泡对内皮祖细胞增殖、凋亡及细胞周期的阻碍，为进一步体内研究提供科学依据。方式：体外提取、分离和培育猪骨髓内皮祖细胞，随机分为对照组、超声组、超声微泡组，干与后24 h别离采纳CCK 8检测细胞增殖活性，PI染色流式细胞仪分析细胞凋亡坏死及细胞周期。结果：（1）低声强超声（ Wcm-2）联合微泡作用下对内皮祖细胞增殖活性无明显阻碍；较高声强（ Wcm-2）作用下，随声强慢慢增大，细胞增殖活性慢慢降低。（2）与对照组

2、比较，超声微泡组（频率1 MHz,输出功率 Wcm-2，辐照90 s）对内皮祖细胞凋亡坏死及细胞周期无明显阻碍，而一样条件下超声组细胞凋亡坏死明显增加，同时显著抑制细胞DNA合成。结论： Wcm-2超声联合微泡干与内皮祖细胞对细胞增殖活性、凋亡坏死及细胞周期无明显不良阻碍，为进一步应用超声微泡体内干与内皮祖细胞移植的研究提供可能。 【关键词】 超声; 微泡； 内皮祖细胞； 增殖； 凋亡； 细胞周期药物医治和血运重建技术的不断进展,使急性心肌梗死的病死率明显降低，但对心肌梗身后心力衰竭仍无有效的医治手腕。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一类能够自

3、我增殖和分化为内皮细胞的干细胞，能增进缺血组织血管新生，增加血流灌注，改善心功能。而超声联合微泡作用能增进组织局部动脉生成，使灌注血流增加；而且在毛细血管壁产生微孔，可能有利于细胞的靶向传输。本实验在体外探讨超声联合微泡对EPCs增殖活性、凋亡坏死及细胞周期的阻碍，为进一步体内研究超声联合微泡增效EPCs医治缺血性心脏病提供依据。 1 材料和方式 11 要紧试剂和设备 淋巴细胞分离液Ficoll Paque（天津灏洋生物公司）、培育液EGM 2（Cambrex公司）、纤维连接蛋白（Fn，Chemicon公司）；DiI标记乙酰化低密度脂蛋白（DiI acLDL,Molecular Probe公司

4、）、FITC标记荆豆凝集素I（FITC UEA I，Sigma公司）；CCK 8试剂盒（碧云天生物科技研究所）、PI凋亡试剂盒（南京凯基生物科技进展）；含氟碳气体脂质体微泡（东南大学生物工程材料国家重点实验室）、荧光正立显微镜（Nicon公司）、CZT 3超声同步医治仪（沈阳新乐康复医疗仪器厂）、BioRad酶标仪、FACS Calibur流式细胞仪。 细胞分离、培育和鉴定 于雄性中国小型猪胫骨近端抽取骨髓约20 ml，加入Ficoll Paque分离液，采纳密度梯度离心法分离单个核细胞，以3105的密度接种于铺有Fn的培育瓶中，培育液用EGM 2。培育至7 d左右行Dil acLDL和FIT

5、C UEA I双染色，记数双阳性细胞为EPCs。 EPCs的干与 培育细胞分为对照组、超声组和超声微泡组3组。实验前将培育的EPCs用胰酶消化制成单细胞悬液，摇匀后以100 l（约5105 ml-1）加入96孔培育板。对照组不做干与，超声组以频率1 MHz、输出功率 Wcm-2持续辐照90 s；超声微泡组加入5 l微泡（约2108 ml-1），以一样超声条件作用90 s。96孔培育板固定在37 双蒸水水槽表面，超声探头垂直置于培育板下方约8 cm处，为幸免超声波对临近孔细胞的阻碍，隔孔接种细胞，每组8孔。 CCK 8测定细胞增殖活性 当孔内细胞生长至60%70%融合时,无血清培育24 h，以、

6、 Wcm-2的不同声强超声联合微泡干与EPCs，继续培育24 h后每孔加入CCK 8溶液10 l，37 孵育12 h，酶标仪上以450 nm测吸光度，细胞增殖越多、越快，那么颜色越深，呈线性关系。 流式细胞仪检测坏死凋亡细胞及细胞周期 各组细胞干与后继续培育24 h，搜集细胞用1 ml冷PBS制成1105 ml-1的细胞悬液,1 000 rmin-1离心10 min，弃上清,将细胞重悬于200 l结合缓冲液中,加入PI液5 l，混匀避光室温反映15 min，再加入300 l结合缓冲液,流式细胞仪以激发波长488 nm检测，结果输入运算机，直接给出凋亡及坏死细胞百分比，同时取得DNA含量散布结果

7、。 统计学处置 采纳SPSS 统计软件包进行数据分析，所有数据用x-s表示，组间比较采纳单因素方差分析（One Way ANOVA），组间两两比较采纳Student Newman Keuls（SNK）查验，P<表示不同有统计学意义。 2 结 果 21 EPCs的鉴定结果 培育第7天贴壁细胞形态以梭形为主，可见圆形及不规那么形细胞。荧光显微镜下，细胞摄取DiI acLDL后呈红色，FITC UEA I染色后呈绿色，双染色细胞中EPCs占90以上（图1）。 22 超声联合微泡作用对EPCs增殖活性的阻碍 、和 Wcm-2不同声强超声微泡组的吸光度值别离为、和（图2）。与对照组（）相较，、和

8、Wcm-2组对EPCs增殖活性无阻碍（P=），和 Wcm-2组EPCs增殖活性明显下降（P）。可见超声联合微泡作用对EPCs增殖活性无阻碍的最大超声能量是 Wcm-2，能够在取得最大生物效应同时平安用于实验研究。图2 不同声强超声联合微泡作用下的吸光度（CCK 8法） 超声联合微泡对EPCs凋亡坏死的阻碍 为了进一步研究 Wcm-2声强超声联合微泡对EPCs的阻碍，用PI染色流式细胞仪分析细胞凋亡坏死情形。检测结果显示对照组为%、超声组为%，两组相较有统计学不同（P<）；超声微泡组为（），与对照组相较无统计学不同（P=）。 超声联合微泡对EPCs细胞周期的阻碍 用流式细胞仪进行细胞周期分

9、析说明， Wcm-2声强超声作用下处于S期的EPCs比例为（），较对照组（）明显减少，有显著统计学不同（P<）；而超声微泡组为（），较对照组反而有轻度增加，但无统计学不同（P=）。见表1。 表1 对照组、超声组与超声微泡组不同细胞周期EPCs 3 讨 论 缺血性心脏病已成为不同收入国家人口死亡的首要缘故，别离占到低中收入和高收入国家患病人口的和1。而干细胞移植以替代、修复或改善受损心肌组织的生物学功能，显示出良好的临床应用前景，但仍存在移植效率低、心功能改善不确信等问题2。超声微泡作为超声增强造影剂，除用于临床诊断外，目前已用于医治相关研究。已有实验证明超声介导毛细血管内微泡破裂可增进正

10、常或缺血大鼠后肢局部动脉生成，灌注血流增加，踏车时刻延长3 5；同时内皮细胞渗透性及细胞间隙增加，有利于基因、药物和细胞靶向渗入组织6。因此咱们假设超声破坏微泡联合冠脉内移植EPCs医治心肌梗死，能够增进心肌内归巢，增强血管生成，增加局部血流灌注，从而进一步改善心功能。本实验在体外研究超声联合微泡增效EPCs医治的可行性和平安性。实验结果提示，低声强（ Wcm-2）超声作用下微泡对EPCs增殖活性无阻碍；高声强（ Wcm-2）作用下，随声强慢慢增大，EPCs增殖活性慢慢降低。为了在体内实验中取得最大生物学效应，如促血管生成、增加血管壁通透性等，咱们选择 Wcm-2声强作为超声实验值，进一步研究

11、其对EPCs凋亡坏死及细胞周期的阻碍。结果说明:与对照组比较，超声联合微泡对EPCs凋亡坏死及细胞周期无明显阻碍，相反超声组明显增加EPCs凋亡坏死，同时显著抑制EPCs的DNA合成。 值得注意的是， Wcm-2单纯超声抑制EPCs增殖，增加细胞凋亡和坏死，而联合微泡作历时对其没有明显阻碍。这与超声干与肿瘤细胞的结果大体一致：Feril等7应用频率1 MHz的超声、 W cm-2)辐照U937肿瘤细胞，持续10 min，观看到两组细胞凋亡都增加。目前以为，上述作用可能与超声的机械作用、热效应和空化效应有关。低强度超声被组织吸收后产生少量热能，增强酶的活性，增进细胞代谢。而较高剂量超声使组织细胞

12、过热致使酶活性破坏，抑制细胞代谢。另外，较高强度超声通过刹时空化效应使细胞膜、DNA和其他细胞结构损伤,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。当有微泡造影剂存在的时候，超声作用下振动微泡周围可产生剪切力，对临近细胞发挥生物学效应8。已有实验说明，剪切力作用下增进EPCs增殖、分化，eNOS mRNA表达和NO生成增加，同时增强Cu/Zn SOD活性9 11。以上作用可能部份排除单纯超声对EPCs的不良作用，但详细机制还需进一步的实验证明。 综上所述， Wcm-2声强的超声联合微泡作用在取得最大生物效应的同时，对EPCs的增殖活性、细胞凋亡坏死及细胞周期无明显不良阻碍，为进一步体内研究超声联合微泡增效EP

13、Cs移植的可行性和平安性提供了依据，从而使超声微泡辅助的干细胞移植有可能从改善移植细胞归巢入手，成为医治缺血性心脏病一种新的有效方式。【参考文献】 1ALAN D L，COLIIN D M，MAJID E，et and regional burden of disease and risk factors，2001:systematic analysis of population health dataJ.Lancet,2006,367:1747 1757.2VINCENT F M S，RICHARD T cell therapy for cardiac diseaseJ.Nature,20

14、20,451:937 942.3JI S，MING Q，SANJIV K，et of arteriogenesis in skeletal muscle by microbubble destruction with ultrasoundJ.Circulation,2002,106:1550 1555.4SONG J I，PATRICK S C，ALEXANDER L，et remodeling and accelerated hyperemia blood flow restoration in arterially occluded skeletal muscle exposed to u

15、ltrasonic microbubble destructionJ.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2004,287(6):H2754 2761.5JUNJI Y，KOJI O，HIROTO T，et of ischemic limbs based on local recruitment of vascular endothelial growth factor producing inflammatory cells with ultrasonic microbubble destructionJ.J Am Coll Cardiol,2005,46:899

16、 905.6SOPHIE H，ALEXANDER L，KLIBANOV in ultrasound triggered drug and gene deliveryJ.Advanced Drug Delivery Reviews,2020,60:1153 1166.7FERIL L B，KONDO T，ZHAO Q L，et of hyperthermial induced apoptosis by non thermal effects of ultrasoundJ.Cancer Lett,2002,178 (1):63 70.8BORIS K，EITAN stress induced by a g