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1、PCR技术扩增目的基因（1）原理：DNA复制（2）过程：加热至9095DNA解链；第二步：冷却到5560，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至7075，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。简记为（1）热变性（2）退火（3）延伸（4）再次重复基因表达载体的构建1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能表达和发挥作用。2构建过程：（1）用特定的限制性内切酶切割目的基因（2）用同一种限制性内切酶切割运载体（3）用DNA连接酶将目的基因和运载体连接起来。3.组成：目的基因启动子终止子标记基因（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚

2、合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗抗生素基因。将目的基因导入受体细胞（转化）1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。将目的基因导入微生物细胞：经钙离子处理

3、得到感受态细胞，然后将重组表达载体与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。第四步：目的基因的检测和表达1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。2.其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的 抗体进行抗原抗体杂交。4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。（三）基因工程的应用1.植物基因工

4、程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。用转基因动物生产药物操作过程：药用蛋白基因+乳腺蛋白基因的启动子哺乳动物的受精卵转基因动物。优点：产量高；质量好；成本低；易提取。缺点：只能是雌性个体在泌乳期时才行。实例：乳腺生物发生器抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和-抗胰蛋白酶等。基因工程药品异军突起 擦亮 shined shined工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系。人胰岛素、细胞因子、抗体、疫苗、激素等。3.基因治疗：把正常或有治疗作用的外源基因导入病人体细胞内，使该基因表达产

5、物发挥作用。beat 击打 beat beaten策略：基因置换、基因修复、基因增补、基因失活。bend 使弯曲 bent bent种类：体外基因治疗和体内基因治疗。受体细胞一般为体细胞而不是受精卵，基因治疗后只有一部分细胞含有正常基因。基因治疗没有影响原有基因，所以细胞中两种基因同时存在。（四）蛋白质工程的概念蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）二、细胞工程（一）植物细胞工程 1.理论基础（原理）：细胞全能性2.植物组织

6、培养技术（1）过程：离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织 试管苗 植物体。learn 学习 learnt / learned learnt / learned植物组织培养的核心：脱分化与再分化。愈伤组织的特点：高度液泡化的无定形状态的薄壁细胞。细胞分裂素/生长素比值低时诱导根分化、比值高诱导芽分化，比值适中时愈伤组织只生长不分化。（2）条件：无菌、适宜的培养基（蔗糖、植物激素）等。cost 花费 cost cost（3）应用：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。withdraw 撤退；收回 withdrew withdrawn（4）地位：是培育转基因植物、植物体细

7、胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。3.植物体细胞杂交技术（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。（二）动物细胞工程1. 动物细胞培养（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）剪碎用胰蛋白酶处理分散成单个细胞制成细胞悬液转入培养瓶中进行原代培养贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快

8、就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。（4）细胞株：传40-50代的传代细胞，遗传物质正常。bear 忍受 bore born细胞系：传50代以后的细胞，遗传物质带有癌变的特点。（5）动物细胞培养需要满足以下条件无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。温度：适宜温度：哺乳动物多是36.

9、50.5；pH：7.27.4。气体环境：95%空气5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。（6）植物组织培养与动物细胞培养的比较：项 目原 理培养基3. 以n结尾的词，在词后加t。如：meanmeant, burnburnt, learnlearnt结 果培养目的baby-sit 临时照顾 baby-sat baby-sat植物组织培养spin 旋转 spun / span spun细胞的全能性固体；营养物质；激素培养成植株快速繁殖；培育无病毒植株等动物细胞培养细胞

10、的增殖液体；血清培养成细胞株或细胞系获得细胞的产物或细胞2.干细胞工程、动物体细胞核移植技术和克隆动物（1）干细胞工程是指在体外对干细胞进行操作，包括体外增殖、定向诱导分化、基因修饰和组织形成等，最终将干细胞培养成人们所需要的各种细胞、组织甚至器官。（2）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。选用去核卵（母）细胞的原因：卵（母）细胞比较大，容易操作；卵（母）细胞细胞质多，营养丰富。（3）体细胞核移植的大致过程是：（4）体细胞核移植技术的应用：加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；保护濒危物种，增大存活数量；生产珍贵的医用蛋白；作为异种移植的供体；用于组织器官

11、的移植等。（5）体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。3.动物细胞融合（1）动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒（特有）、电刺激（重复性强，对原生质伤害小，方法简单，诱导过程可控性强）等。（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。（4）动物细胞融合

12、与植物体细胞杂交的比较：比较项目细胞融合的原理细胞融合的方法诱导手段用法植物体细胞杂交细胞膜的流动性去除细胞壁后诱导原生质体融合离心、电刺激、振动，聚乙二醇等试剂诱导克服了远缘杂交的不亲和性，获得杂种植株动物细胞融合使细胞分散后诱导细胞融合除应用植物细胞杂交手段外，再加灭活的病毒诱导制备单克隆抗体的技术之一4.单克隆抗体（1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。（2）单克隆抗体的制备过程：（3）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。（4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。（5）单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准

13、确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。三、胚胎工程（一）动物胚胎发育的基本过程1、胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割等技术。经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。操作对象：早期胚胎和配子技术手段：胚胎移植、体外受精、胚胎分割等理论基础：哺乳动物受精和早期胚胎发育的规律2、动物胚胎发育的基本过程（1）受精场所是母体的输卵管壶腹部。（2）卵裂期：特点：细胞有

14、丝分裂，细胞数量不断增加，但胚胎的总体体积并不增加，或略有减小。 （3）桑椹胚：胚胎细胞数目达到32个左右时，胚胎形成致密的细胞团，形似桑椹。是全能细胞。（4）囊胚：细胞开始出现分化（该时期细胞的全能性仍比较高）。聚集在胚胎一端个体较大的细胞称为内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织。中间的空腔称为囊胚腔。（5）原肠胚：有了三胚层的分化，具有囊胚腔和原肠腔。（二）胚胎干细胞1、哺乳动物的胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或从原始性腺中分离出来。2、具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上，具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培

15、养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。3、胚胎干细胞的主要用途是：可用于研究哺乳动物个体发生和发育规律；是在体外条件下研究细胞分化的理想材料，在培养液中加入分化诱导因子，如牛黄酸等化学物质时，就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段；可以用于治疗人类的某些顽疾，如帕金森综合症、少年糖尿病等；利用可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能；随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，定向培育出人造组织器官，用于器官移植，解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问

16、题。（三）胚胎工程的应用1.体外受精和胚胎的早期培养（1）卵母细胞的采集和培养：主要方法：用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后，从输卵管中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。第二种方法：从刚屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞；第三种方法是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。采集的卵母细胞，都要在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。（2） 精子的采集和获能：在体外受精前，要对精子进行获能（获能液）处理。（3） 受精：获能的精子和培养成熟的卵细胞在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。（4）胚胎的早期培养：精子与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续

17、培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力。培养液成分较复杂，除一些无机盐和有机盐外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。不同动物胚胎移植的时间不同。（牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植，小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体外受精胚胎可在4个细胞阶段移植。）2.胚胎移植（1）胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其它方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其它雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的个体称为“受体”。（供体为优良

18、品种，作为受体的雌性动物应为常见或存量大的品种。地位：如转基因、核移植，或体外受精等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎，都必须经过胚胎移植技术才能获得后代，是胚胎工程的最后一道“工序”。（2） 胚胎移植的意义：大大缩短了供体本身的繁殖周期，充分发挥雌性优良个体的繁殖能力。（3） 生理学基础：动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎的收集提供了可能。受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能。供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特

19、性在孕育过程中不受影响。（4） 基本程序主要包括：对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和受体是同一物种。并用性激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。配种或人工授精。对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来（也叫冲卵）。对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段。直接向受体移植或放入196的液氮中保存。对胚胎进行移植。移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。3.胚胎分割是指采用机械方法将早期胚胎切割2等份、4等份等，经移植获得同卵双胎或多胎

20、的技术。（2）意义：来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，属于无性繁殖。（3）材料：发育良好，形态正常的桑椹胚或囊胚。（桑椹胚至囊胚的发育过程中，细胞开始分化，但其全能性仍很高，也可用于胚胎分割。（4）操作过程：对囊胚阶段的胚胎分割时，要将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。（五）生物技术的安全性和伦理问题1.转基因生物的安全性争论 ：（1）基因生物与食物安全：反方观点：反对“实质性等同”、出现滞后效应、出现新的过敏原、营养成分改变正方观点：有安全性评价、科学家负责的态度、无实例无证据（2）转基因生物与生物安全：对生物多样性的影响扩散到种植区之外变成野生种类、成为入侵外来

21、物种、重组出有害的病原体、成为超级杂草、有可能造成“基因污染”生命力有限、存在生殖隔离、花粉传播距离有限、花粉存活时间有限（3）转基因生物与环境安全：对生态系统稳定性的影响打破物种界限、二次污染、重组出有害的病原微生物、毒蛋白等可能通过食物链进入人体不改变生物原有的分类地位、减少农药使用、保护农田土壤环境2.生物技术的伦理问题（1）克隆人：两种不同观点，多数人持否定态度。否定的理由：克隆人严重违反了人类伦理道德，是克隆技术的滥用；克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理道德观念；克隆人是在人为的制造在心理上和社会地位上都不健全的人。肯定的理由：技术性问题可以通过胚胎分级、基因诊断和染

22、色体检查等方法解决。不成熟的技术也只有通过实践才能使之成熟。中国政府的态度：禁止生殖性克隆，不反对治疗性克隆。四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人的实验。（2）试管婴儿：两种目的试管婴儿的区别两种。不同观点，多数人持认可态度。把试管婴儿当作人体零配件工厂，是对生命的不尊重；早期生命也有活下去的权利，抛弃或杀死多余胚胎，无异于“谋杀”。解决了不育问题，提供骨髓中造血干细胞救治患者最好、最快捷的方法，提供骨髓造血干细胞并不会对试管婴儿造成损伤。（3）基因身份证：个人基因资讯的泄漏造成基因歧视，势必造成遗传学失业大军、造成个人婚姻困难、人际关系疏远等严重后果。通过基因检测可以及早采取预防措施，适时进行治疗，达到挽救患者生命的目的。3.生物武器（1）种类：致病菌、病毒、生化毒剂，以及经过基因重组的致病菌。（2）散布方式：吸入、误食、接触带菌物品、被带菌昆虫叮咬等。（3）特点：致病力强、多数具传染性、传染途径多、污染面广、有潜伏期、不易被发现、危害时间长等。（4）禁止生物武器公约及中国政府的态度