新版动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法作业指导书.docx

1、新版动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法作业指导书 作 业 指 导 书OPERATING INSTRUCTIONS动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法 编号：XZJY081-00-2019 版本：第一版 第0次修改 编制： 审核： 批准： 实施日期： 作业指导书文 件 编 号： XZJY081-00-2019版本号/修订状态： 一/第0次修改 动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法页码/总页数： 1/9实 施 日 期： 2019.01.011、编制目的为规范动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量的检验方法，编制

2、本指导书。二、适用范围本指导书适用于动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量的测定。 三、编制依据GB/T 21311-2007动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量的检验方法 高效液相色谱/串联质谱法四、实验原理样品经盐酸水解，邻硝基苯甲醛过夜衍生，调pH值7.4后，用乙酸乙酯提取，正乙烷净化。分析物采用高效液相色谱/串联质谱定性检测，采用稳定同位素内标法进行定量测定。5、试剂和材料除非另有说明,所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。5.1 试剂5.1.1 甲醇：高效液相色谱级。5.1.2 乙腈：高效液相色谱级。5.1.3 乙酸乙酯：高效液相色谱纯。5.1.4 正乙烷：高效

3、液相色谱级。5.1.5 浓盐酸。5.1.6 氢氧化钠。5.1.7 甲酸：高效液相色谱级。作业指导书文 件 编 号： XZJY081-00-2019版本号/修订状态： 一/第0次修改 动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法页码/总页数： 2/9实 施 日 期： 2019.01.015.1.8 邻硝基苯甲醛5.1.9 三水磷酸钾5.1.10 乙酸铵5.2 试剂配制5.2.1 0.2 mol/L盐酸溶液：准确量取17ml浓酸盐（5.1.5），用水定容至1L。5.2.2 2.0 mol/L氢氧化钠溶液：准确称取80g氢氧化钠（5.1.6），用甲醇溶解并定容至1L。5.

4、2.3 0.1 mol/L邻硝基苯甲醛溶液：准确称取1.5g邻硝基苯甲醛（5.1.8),用甲醇溶解并定容至100ml。5.2.4 0.3 mol/L磷酸钾溶液：准确称取79.893g三水磷酸钾（5.1.9），用水溶解并定容至1L。5.2.5 乙腈饱和的正乙烷：量取正乙烷80ml于100ml分液漏斗中，加入适量乙腈后，剧烈振摇，待分配平衡后，弃去乙腈层既得。5.2.6 0.1%甲酸水溶液（含0.0005mol/L乙酸铵）：准确称取1ml甲酸和称取0.0386g乙酸铵于1L容量瓶中，用水定容至1L。5.2.7 标准物质：3-氨基-2-恶唑酮、5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮、1-氨基-乙内酰

5、脲、氨基脲，纯度99%。5.2.8 内标物质：3-氨基-2-恶唑酮的内标物，D4-AOZ;5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮的内标物，D5-AMOZ;-氨基-乙内酰脲的内标物,13C-AHD;氨基脲的内标物，13C15N-SEM，纯度99%。5.2.9 标准储备液：分别准确称取适量标准品（精确至0.0001g），用乙腈溶解，配置成浓度为100ml/L的标准储备液，-18冷冻避光保存，有效期作业指导书文 件 编 号： XZJY081-00-2019版本号/修订状态： 一/第0次修改 动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法页码/总页数： 3/9实 施 日 期：

6、 2019.01.013个月。5.2.10 混合中间标准溶液：准确移取标准储备液各1ml于100ml容量瓶中，用以乙腈定容至刻度，配置成浓度为1ml/L的混合中间标准液，4冷藏避光保存，有效期1个月。5.2.11 混合标准工作溶液：准确移取0.1ml混合标准储备液各于10ml容量瓶中，用以乙腈定容至刻度，配置成浓度为0.01ml/L的混合标准工作溶液，4冷藏避光保存，有效期1周。5.2.12 内标储备液：准确移取内标物质（精确至0.0001g），用乙腈溶解，配置成浓度为100ml/L的标准储备溶液，-18冷藏避光保存，有效期3个月。5.2.13 中间内标标准溶液：准确移取1ml内标储备液于10

7、0ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配置成浓度为1mg/L的中间内标标准溶液，4冷藏避光保存，有效期1个月。5.2.14 混合内标标准溶液：准确移取中间内标标准溶液各0.1ml于10ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配置成浓度为0.01ml/L的混合内标标准溶液，4冷藏避光保存，有效期1周。5.2.15 微孔滤膜：0.20um，有机用。5.2.16 氮气：纯度99.999%。5.2.17 氩气：纯度99.999%。六、仪器和设备6.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。6.2 组织捣碎机。6.3 均质器：10000r/min。作业指导书文 件 编 号： XZJY081-00-201

8、9版本号/修订状态： 一/第0次修改 动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法页码/总页数： 4/9实 施 日 期： 2019.01.016.4 振荡器。6.5 分析天平:感量0.0001g，0.01g。6.6 氮吹仪。6.7 恒温箱。6.8 pH计：测量精度0.02pH单位。6.9 离心机：10000r/min。6.10 旋涡混合器。6.11 移液枪：100L、1mL、5ml。6.12 容量瓶：1L、100ml、10ml。6.13 具塞塑料离心管：50ml。6.14 刻度管：10ml七、分析步骤7.1 试样制备7.1.1 肌肉、内脏、鱼和虾从原始样品中取出有代

9、表性样品约500g，用组织捣碎机充分捣碎成混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于-18冷冻避光保存。7.1.2 肠衣 从原始样品中取出有代表性样品约100g，用剪刀剪成边长5mm的方块，混匀后均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于4冷藏避光保存。7.1.3 蛋从原始样品中取出有代表性样品约500g，去壳后用组织捣碎机充分捣碎成混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于4冷藏避光保存。作业指导书文 件 编 号： XZJY081-00-2019版本号/修订状态： 一/第0次修改 动物源性食品中硝基呋喃类药物

10、代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法页码/总页数： 5/9实 施 日 期： 2019.01.017.1.4 奶和蜂蜜从原始样品中取出有代表性样品约500g，用组织捣碎机充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于4冷藏避光保存。注：在制样的操作过程中，应防止样品污染或残留含量发生变化。7.2 样品处理7.2.1 水解和衍生化7.2.1.1 肌肉、内脏、鱼、虾和肠衣称取约2g试样(精确至0.01g)于50ml塑料离心管中，加入10ml甲醇-水混合溶液（1+1，体积比），振荡10min后，以4000r/min离心5min，弃去液体，残留物中加入10ml 0.

11、2mol/L盐酸，用均质器以10000r/min均质1min后，再依次加入混合内标标准溶液100ul，邻硝基苯甲醛溶液100ul，涡动混合30s后，在振荡30min，置37恒温箱中过夜（16h）反应。7.2.1.2 蛋、奶和蜂蜜称取约2g试样(精确至0.01g)于50ml塑料离心管中，加入10ml20ml0.2mol/L盐酸（以样品完全浸润为准），用均质器以10000r/min均质1min后，再依次加入混合内标标准溶液100ul，邻硝基苯甲醛溶液100ul，涡动混合30s后，在振荡30s，置37恒温箱中过夜（16h）反应。7.2.2 提取和净化取出样品，冷却至室温，加入1ml2ml0.3mol

12、/L磷酸钾（1ml磷酸钾溶液），用2.0mol/L氢氧化钠调pH7.4（0.2）后，再加入10ml20ml乙酸乙酯（乙酸乙酯加入体积与盐酸溶液体积一致），振荡提取10min后，以10000r/min离心10min，收集乙酸乙酯层。残留物用10ml20ml乙酸乙酯再提取一次，合并乙酸乙酯层，收集液在40以下用N2吹干，残渣用1ml 作业指导书文 件 编 号： XZJY081-00-2019版本号/修订状态： 一/第0次修改 动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法页码/总页数： 6/9实 施 日 期： 2019.01.010.1%甲酸水溶液溶解。再用3ml乙腈饱和

13、的正乙烷分两次液液分配,取出脂肪，下层水相过0.20um微孔滤膜后，取10ul供仪器测定。7.2.3混合基质标准溶液的制备7.2.3.1 肌肉、内脏、鱼、虾和肠衣称取5份约2g的隐形试样（精确至0.01g）于50ml塑料离心管中，加入10ml甲醇-水混合溶液（1+1，体积比）。振荡10min后，以4000r/min离心5min，弃去液体。残留物中加入10ml 0.2mol/L盐酸，用均质器以10000r/min均质1min后，按照最终定容浓度：1、5、10、50、100ng/ml，分别加入混合中间标准溶液或混合标准工作溶液，再加入混合内标标准溶液100ul，余下操作同上。7.2.3.2 蛋、奶

14、和蜂蜜 称取5份约2g的隐形试样（精确至0.01g）于50ml塑料离心管中，加入10ml20ml 0.2mol/L盐酸，用均质器以10000r/min均质1min后，按照最终定容浓度：1、5、10、50、100ng/ml，分别加入混合中间标准溶液或混合标准工作溶液，再加入混合内标标准溶液100ul，余下操作同上。8、测定8.1 液相色谱条件色谱柱：XTcrra MS C18,150mm2.1mm（内径），3.5um，或相当者；柱温：30；流速：0.2ml/min；进样量：10ul；流动相及洗脱条件见表1.作业指导书文 件 编 号： XZJY081-00-2019版本号/修订状态： 一/第0次修

15、改 动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法页码/总页数： 7/9实 施 日 期： 2019.01.01表1 流动相及梯度洗脱条件时间/min流动相A（乙腈）流动相B（0.1%甲酸水溶液）010%90%7.0090%10%10.0090%10%10.0110%90%20.0010%90%8.2 串联质谱条件毛细管电压：3.5kv；离子源温度：120；去溶剂温度：350；锥孔气流：氮气，流速100L/h；去溶剂气流：氮气，流速600l/h；碰撞气：氩气，碰撞气压2.6010-4Pa；扫面方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM），监测条件见表A.1作业指导书文 件 编 号： XZJY081-00-2019版本号/修订状态： 一/第0次修改 动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方