HPLC分离技术Word下载.docx

1、水豺卜載止KR/nm1903W0265210245233卜丄L - 21233020S1S74高纯度，不纯的试剂会引起基线不稳定，或产生“伪峰”.5低粘度，溶剂黏度过高，使压力增加，不利于分离；粘度过低， 容易产生气泡；常用低粘度溶剂有丙酮、乙腈、甲醇等.B、液一固色谱的流动相在液一固吸附色谱中，流动相称为洗脱剂.对极性大的组分采用 极性强的洗脱剂；反之，采用极性弱的洗脱剂.在实际工作中，溶剂的选择需通过实验来确定，合理配制二元溶 剂，精细控制组分的K值，有可能使大多数样品组分实现良好分离.如 果组分的K值范围很宽，则应采取梯度洗脱.C液一液色谱的流动相在液一液分配色谱中，流动相与固定相的极性

2、差异越大越好.正 相分配色谱的流动相是以烃类（如己烷、庚烷等）为主，加入少量极性 溶剂（如氯仿、甲醇等）改变流动相的极性和组成。反相分配色谱流动 相是以水为主，再加入能与水混溶的有机溶剂，通过改变有机溶剂的 组成，调整试样组分的容量因子，改善分离效率.甲醇是最常用的有 机溶剂，其次是乙醇和四氢咲喃.D、键合相色谱键合相色谱中固定相很稳定，不容易流失，适合于梯度洗脱.不同键合相色谱流动相的选择可参见表 18. 7.ais.7比学逢合固定相的选择祥骷艸嶷流 ftl1色猜覧世实馆-clfl屮静体甘油二弗 凑雅，脂辭性縦生索中等機性 可iff于尊-CN-NHz乙At.正己燒正相脂榕性堆生視、信典、甘音

3、醉、威-熒ih止芳善BE血、氯比农西、雜二甲*Via-Q亠CN甲馭水乙朋1反相诩裁.町辭于醉的尺然产捕、堆9當JJ忡-G甲諄、乙IT水 1St冲樁読反tti水幡件皓牛臥胺.芳髀，抗甫索4痛的可椿T水C.反IU厲子时-SQj-木T风冲iff灌H子处揍无机阳鳥予、氨朮（ft權缉冲请藏屈再子亶换AL大就阴禺f .令机隈在非极性键合相色谱中，若用水一甲醇、水一乙腈溶液为流动相， 可分离极性物质；若用水和无机盐的缓冲溶液作流动相， 可以分离易 离解的物质，如有机酸、有机碱、酚类等.从而克服正相吸附色谱分 离这些物质时的柱效低和容易产生拖尾峰等缺点.在极性键合相色谱中，常在非极性或小极性溶剂（如烃类）中加

4、入 适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）为流动相，分离异构体、极性 化合物等.使用的流动相，和液固色谱、液液色谱使用的流动相有相似之处。a、溶剂的选择性分组常见溶剂的极性参数P和选择性参数Xe Xd和Xn。当将每种溶 剂的三种Xe Xd和Xn值组成一个三角形坐标时，选择性相似的溶剂 分布在三角形平面中的一定区域内，从而构成选择性不同的溶剂分 组。图46为溶剂选择性分组的三角形坐标图。 表4 2列出了依据溶剂选择性分组的各种有机化合物的类型审性衰山2涪捌的选择性分组濬制名称1脂肪族ML二级熄監*四甲墓4L六甲基詹験胺毗碇術生物.四氢映咄*籬胺（除用離腰外人 乙二轉隔、IV乙二醉、荼甲醉.甲醸胺乙

5、醴V二氯甲煤、二氯乙烷叽磷腰三甲苯酯、脂肪秋爾利肅.戢酗二H层歼vihWT. 0U碳酸內烯酯VI硝基化合物、苛香醛、苏煙、卤代芳炬臥烷醇阖甲華酚.担仿.水由溶剂选择性分组的三角形坐标图可知，常用溶剂可分为8个选择 性不同的特征组，处于同一组中的溶剂具有相似的特性。 因此对某一 指定的分离，若某种溶剂不能给出良好的分离选择性， 就可用另一种 其他组的溶剂来替代，从而可明显地改善分离选择性。对甲醇、乙腈、四氢咲喃、乙醚、氯仿、二氯甲烷、水等常用溶剂，各处于第几选择性组，应有清晰的了解b、在键合相色谱中选择流动相的一般原则在键合相色谱分析中常使用二元混合溶剂作为流动相，此时流动 相的极性参数 P,可

6、按下述实例进行计算。 二元混合溶剂的极性 参数P为：式中P a、Pb 一一分别为溶剂A和溶剂B的极性参数， a、 b%分别为溶剂A和溶剂B在混合溶剂中所占的体积 分数。在正相键合相色谱中，流动相的主体成分为己烷（或庚烷），为改 善分离的选择性，常加入的优选溶剂为 质子接受体乙醚或甲基叔丁基 醚（第1组）；质子给予体氯仿（第忸组）；偶极溶剂二氯甲烷（第V组）。在反相键合相色谱中，流动相的主体成分为水 。为改善分离的选 择性，常加入的优选溶剂为 质子接受体甲醇（第H组）、质子给予体乙 腈（第W b组）和偶极溶剂四氢咲喃（第皿组）。表43和表44分别列出在正相色谱和反相色谱中使用的某些 混合溶剂的特

7、性，表达了当向己烷（或庚烷）、水中加入强洗脱溶剂后， 引起溶质容量因子K下降的倍数。 4 3正相色谓使用的墓些混合濬剂的特性于已烷中加入朗体积的漏洗脱祷搁时. 押值下降的借敷0” 11.0 U2 4乙髓鑫8K6 *二氯甲烷3. 1L7 -四短咲（W4* 02* 0氮仿412*2乙餓乙穂4. 42. 0乙醉32+ 0*5. g2.6甲醉5.123优选溶刑.4 4反栩色谱使用的某些混合涪剂的特性; P 于水中加入2%怵积的强洗脱轉列时,F値下降的倩数10.2二甲亚真7,21-5乙二詡6+9K5乙护8 .2*05” 1丙5- 14-B2.2银32*3四包咲哺+- 02- 8异丙諄3. 93. 0D优

8、选溶fft当使用二元混合溶剂时，在正相色谱的情况下，以正己烷 （H）作为流动相主体，其Ph1,它和极性溶剂A组成H/A混合流动相， 若其Pmix对给定的分离有合适的溶剂强度，即被分离溶质的k在 110之间。为改善分离的选择性，欲用另一极性溶剂B代替A,重新组成H/ B混合流动相，在保持极性参数Pmix不变和已知A组分 体积分数巾A的条件下，.可按下述计算出将H/A改变为H/B时，所需B组分的体积分数巾B。彌 Ph+a Pa= Fh+ Pb由于PH 1，可近似认为：弘 Pa=9% PbPR初=耗耳在反相色谱的情况下，水（W）作为流动相的主体，它与极性溶剂M组成W/M二元混合流动相，若 其Pmix

9、给定的分离有合适的溶剂 强度，即对样品组分有合适的 K值。为改善分离的选择性，欲用另 一极性溶剂T代替M重新组成 WT混合流动相，在保持Pmix不 变和已知M组分体积分数巾m的条件下，也可计算所需T组分的体积 分数巾T。驹科十他FL尸驹P卄穴Pt（1池I）P& +驹凡=（1件）Pwpr PtP Pm0=阳凤二耳13、溶质保留值随溶剂极性变化的一般保留规律图410表达了作为极性函数的样品和溶剂，在正相色谱和反相色谱中，选择不同极性溶剂作流动相时，引起不同极性溶质 （AB）的 保 留 值 变 化 的一般 规 律。样品彼性增加*1溶剂E人丄爪 包人A壬21迺常便用中等或?遇扱性13症粗/OJ|爼分捧

10、品极性弗加性洛剂迪常便用非枫性 或弱极性同定柏图4 ID溶质保留值随它和溶剂极性变化的一般保留规律在正相色谱（图410上半部）中，使用弱极性溶剂作流动相,则极性弱的B组分先流出，A组分后流出。当更换中等极性溶剂作流 动相时，二者流出顺序不变，但它们的保留值都进一步减小。在反相色谱（图4，10下半部）中，使用中等极性溶剂作流动相，则极性强的A组分先流出，B组分后流出；当更换强极性溶剂作流动相时，二者流出顺序不变，但它们的保留值会进一步增大。反相 ai 术授 术典埜 的淒动相常救反祐技术AHiO + MeCN. MeOH?f控勿离子代技发3=A+S冲涪液雋子押制技水对于璨.离子对色谱对子阳器子U丰

11、烷墓确啟盐等対子胡寓子* B +華錢盐等次级化羊乎窗快B-AE* 第非水反相技朮； MeOHi MeCN + THF, CHjChE、离子交换色谱流动相离子交换色谱流动相通常是盐类的缓冲溶液. 通过改变流动相的pH缓冲溶液的类型、离子强度、以及加入有机溶剂、配合剂都会改 变分离选择性，提高分离效果.流动相pH值大小控制酸碱离解平衡，从而控制了酸、碱组分的 离子百分数.离子的比例越大，k值越大；反之，k值就小.若组分 都以分子形式存在，则不被固定相保留.弱酸或弱碱的保留值取决于 流动相的pH值.流动相的pH值是通过加入缓冲剂来调控.对阴离子交换树脂，各种阴离子的保留能力次序为：柠檬酸 根离子 S

12、O C2（OI HS04N0-CrOBrSCNC甲酸盐乙酸 盐0H L.所以用柠檬酸根离子作流动相，各组分阴离子的保留值 最小，反之，用氟离子作流动相，组分的保留值最大.对阳离交换树脂，各种阳离子的保留能力顺序为：Fe3+ Ba2+pb2+Sr2+Cca+Ni2+Ccj+CUi+CO：+Zn2+M（g+U（22+Tl +Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li +加入配合剂，可以利用不同阳离子的配合常 数差别，提高了分离的选择性配合常数大的阳离子，由于以配合物 或配合离子存在，以金属离子存在的比例减小， K值也随之减小.调节流动相的 pH 值或利用配位体缓冲溶液 （金属离子的盐与其配合物

13、配制的溶液 ）控制配位体浓度，从而可以控制阳离子以配合物存在的 比例充分利用配合剂的选择，提高分离效率F 、空间排阻色谱流动相 在空间排阻色谱中，流动相的选择不是为了提高色谱柱的选择 性，而是为了使样品更好地溶解，或是为了减少流动相黏度，提高柱 效.选用低黏度的流动相，其沸点要比柱温 2550 C,而且应与选用的固定相和检测器相匹配例如，采用聚苯乙烯为固定相，不利用 强极性溶剂 （ 醇类、丙酮、二甲亚砜、 水） 为流动相. 以硅胶为固定相， 可选用的流动相很多.此时，利用水溶液为流动相，其 pH 值应控制28. 5范围内。二、分离操作条件优化的选择进行高效液相色谱分析， 选择适用的色谱柱， 尽

14、可能采用优化的 分离操作条件， 可使样品中的不同组分以最满意的分离度、 最短的分 析时间、最低的流动相消耗、最大的检测灵敏度获得完全的分离。1、容量因子和死时间的测量HPLC分析中，容量因子K是一个非常重要的参数，它对如何选择流动相的溶剂组成、 改善多组分分离的选择性都发挥着重要的作用。容量因子可按下式计算：心12、样品组分保留值和容量因子的选择希望完成一个简单样品的分析时间控制在 10 一 30min之内，若为 含多组分的复杂样品，分析时间可控制在 60min以内。若使用恒定组成流动相洗脱，与组分保留时间相对应的容量因子 k应保持在1 10之间，以求获得满意的分析结果。对组成复杂、由具有宽范

15、围 k 值组分构成的混合物，仅用恒定组 成流动相洗脱.在所希望的分析时间内，无法使所有组分都洗脱出来。 此时需用梯度洗脱技术，才能使样品中每个组分都在最佳状态下洗脱出 来。当使用梯度洗脱时通常能将组分的 k值减小至原来的I/10 一 1 /100,从而缩短了分析时间。保留时间和容量因子是由色谱过程的热力学因素控制的，可通过改变流动相的组成和使用梯度洗脱来进行调节。在常规色谱条件下，如K值过大，应增加溶剂的极性，在反相色 谱的情况下，K值过大，应降低溶剂的极性正相溶剂序列：水（极性最大乙腈t甲醇t异丙醇t四氢咲 喃-乙酸乙酯-氯仿-苯-甲苯-正己烷反相色谱中，水是弱溶剂，在甲醇/水为流动相的系统

16、中增加 甲醇的比例，流动相变强。反相色谱中，流动相中的有机溶剂增加 10%, tR和K值要减少2-3倍3、相邻组分的选择性系数和分离度的选择各种色谱分析方法的共同目的都是要以最低的时间消耗来获 得混合物中各个组分的完全分离。在色谱分析中通常规定，当色谱图 中两个相邻色谱峰达到基线分离开时， 其分离度R= 1.5。若分离度R =1. 0,表明两个相邻组分只分离开 94%，可作为满足多组分优化分 离的最低指标。由影响分离度各种因素的计算公式：J * 4 。 1十赵可以看出分离度是受热力学因素容量因子k和选择性系数a （ a =k2 /k1）和动力学因素（理论塔板数n）两个方面控制的。表勺3选择性系

17、數h对分亀盛的影响 SW 容因子护取分厲度的帕响学肿=3, k= L 0时对底丁术同的 样不同的对us fl h W &佰所需的沖但 il 値c_ _ t Za L 05t-1. 10L （105打頂XXX） Q. |85J7JiCL（490（X10 q 3知慟3700J. CIS価规 0.517宓h ci740001.02fi31O77；K!拠2-915SM?43-iOJ. JC3409sx 弘DM*027J0h 201020茨 0 10 0HSdO如0站00110 2077S412!5C表9-3，对给定k = 3的组分，其与相邻组分的分离度R= 1. 0时，若它们的选择性系数a为不同值时所

18、对应的理论塔 板数”。表94,对具有不同k值的相邻组分，若它们的选择性 系数a分别为1. 05、1. 10且使分离度R= 1. 0时所对应的理 论塔板数 n。若相邻组分的容量因子在 110 之间, R 选择性系数保持大 1：1. o 51. 10 以上,就比较容易达到满足多组分优化分离的最低分 离度指标，即R= 1. 0。当选定一种高效液相色谱方法时, 通常很难将各组分间的分离 度都调至最佳, 而只能使少数几对难分离物质对的分离度至少保持 R =1. 0。若Rv 1. 0,仅呈半峰处分离，则应通过收变流动相组成或 改变流动相流速，调节分离度尽可能使 R= 1. 0,这样才能满足淮确 定量分析的

19、要求。对于两个浓度相等的组分，当Rs=1.5时，两个峰达到基线的完全 分离，叫做6c分离。若在两峰转折处分别收集两组分，被分离的两 组分均可达到 99. 9%的纯度。若 Rs=1 这时两烽尖间的距离等于 4, 叫做。分离，两峰只有3%的重叠，两组分的纯度都可达98%，回收 率都是 98%。不过, 当两峰浓度不相等时, 如第一个峰与第二个峰浓 度之比为10: 1，若Rs= 1. 5,则组分I可全部回收，纯度为100%, 而组分2只能回收99%，纯度为99. 7%。若Rs=l,则组分2的回收 率降到只有 88%,纯度为 98%。对定性分析，Rs=0.8通常被认为是最低要求。对于浓度比为1 :1的两

20、组分，回收纯度可达95%。当谱图中出现相邻组分的重叠色谱峰时.不宜进行定量分析，若使用微处理机可计算出重叠组分各自的峰面积相含量， 但不能提供准确可靠的分析结果玻度比 2/1 8/1图223分离度与俎分相对裁度的关系6H計站出裁瞅畫比冒分离虞的昊系Nt帯祥；Curtail-AXf F费和.ETW-IE Ctt 1d 崔力，叫“ doW/cnL样品，1.对“二确薑草，a. | 丨 I I N l II .肘闻图加M参组弁分离的亦离度对多组分的分离，不能笼统地说分离度如何，应当说明是指哪 一对峰的分离度。例如，象图 2、25那样比较复杂的色谱图，如果所 有的峰的分离都是重要的，则整个色谱分离的分离

21、度取决于分离度最 低值的两个峰。图2. 25中的峰I与峰2的分离度有最低值（约为0.8）, 就是这张色谱图的分离度。如果不是这张色谱图上所有的峰都重要， 只是第4个峰是我们主要关心的组分，此时，就要看峰3与峰4及峰4 与蜂5中哪个分离度较低，才能确定分离度。在图2 25中，确定峰3 与峰4的分离度比峰4与峰5的要差些，故将峰3与峰4分离度的数 值（一 1. 0）作为这张色谱图的分离度。三、HPLC常遇问题a进行未知样品分析时经常遇到的另一个问题.是样品中的全 部组分是否都从键中洗脱出来，是否还有强保留组分被色谱柱中的固 定相吸留。解决此类问题是比较困难的，通常对同一种样品可采用两种不同的高效液

22、相色谱法进行分析。如可先采用硅胶吸附色谱法分析， 若考 虑有可能将强极性组分滞留；可再采用反相键合相色谱法分析.此时 强极性组分会首先被洗脱出来，从而可判断强极性组分是否存在。 对 大部分未知样品来讲，至少应将两种完全独立的高效液相色谱方法配 合使用.最后才能得到有关样品组成和含量的确切结论。B、容量因子k寸分离的作用也是显而易见的。K是溶质在固定相u Y 一匕和移动相中的分子数之比 仏尸:故1V 就是溶质分子在固定相中的分数若k= 0,组分在固定相中的分数为零，即 组分不被保留，组分的保留时间，tr = tm,分离不能实现。当k值增大_匕时，保留时间随之增加。不过，k值足够大时，贝“亍匚0”

23、项趋近于1；, 它对分离度的改善就不再起作用。相反的，由于 k的增大，保留时间 亦随之延长，因峰的扩展作用而使检测困难。因此从分离度、分离时间及对峰的检测出发，存在 k最佳值的范围，这时，1 + P值处于最大值的范围。从表2. 8,我们看出亠V随k而变化的情况，即 分离度R值随忙匚0“变化的情况。u n I j jI-A!1 I3 j 4 57上.HT 1 - M ! Ja U go 81 fs 宀；77ru1 wC.76 1 S 旳! 4虻0.8t（J.91 1 C.EjS 1*帅1十血-I- - 1 j从小于1增加至5时，十L值的增大很快。在k值增大 至10以后，随精k的增大，I +L的增

24、加较慢。值超过10 之后，k值增大对R的影响就很小。因此，k最佳范围应当是1 v kv 10。在这个k值范围，既可保证大的分离度亦可以使分离时 间不至于过长，使峰的扩展不会太严重而对检测发生影响。液相色谱分离对k 值的控制，通常是借助于选用溶剂强度不同的移动相来实现的。 选用强度强的溶剂作为移动相，溶质的 k 值 小，保留时间短；反之，选用强度弱的溶剂作为移动相，溶质的 k值 大，保留时间长。因此，通过选用强度不同的移动相，可以控制组分的k值。对一个初步分离，如果k太小（kv 1,应选用强度弱的 移动相；若k值太大，则应选用强度强的移动相。这样，通常选用溶 剂强度不同的移动相，就可找到对分离台

25、适的移动相强度， 将k值控 制在最佳的范围即（1v kv 10 =四、定性分析定性分析就是要确定样品中的一些未知组分是什么物质。色谱分析中的定性主要是依据特征性不是很强的保留值， 这需要和已知的标准物质的保留值进行比对。由于即使保留值完全相同的两个 峰，也可能是不同的物质，因此在最终准确确定色谱图中某个峰是什 么物质时还需要一些辅助技术。1、 利用保留值定性利用保留值定性是最基本的定性方法， 其基本依据是： 两个相同 的物质在相同的色谱条件下应该有相同的保留值。但是，相反的结论 却不成立， 这就使得使用保留值定性时必须十分慎重。由于影响保留 值的因素色谱中的固定相和流动相在气相色谱和液相色谱中不完 全相同，因此用保留值定性的方法在气相色谱和液相色谱中也不尽相 同，下面就分别介绍气相色谱和液相色谱中用保留值定性的方法。2、液相色谱中用保留值定性的方法与气相色谱相比， 液相色谱的分离机理就复杂多了， 不仅仅是 吸附和分配，还有离子交换、体积排除、亲核作用、疏水作用等。组 分的保留行为也不仅只与固定相有关，还与流动相的种类及组成有关 （气相色谱中组分的保留行为只与固定相种类和柱温有关，而与流动相 种类无关 ）。因此液相色谱中影响保留值的因素比气相色谱中要多很 多。 不能直接用保留指数 （Kovats 指数）定性。在液相色谱中保留值定