小鼠免疫力对接种人类肝癌细胞系9724生长的影Word下载.docx

1、目的 探讨不同免疫力小鼠的免疫细胞对人类肝癌细胞系9724生长的影响及异种特异性细胞毒杀伤能力. 方法 将培养后的人类肝癌细胞系接种到不同免疫力小鼠（免疫正常的BALB/c，B缺陷的CBA/N，T缺陷的BALB/c nude及T，B缺陷的C.B-17SICD小鼠）右后臀皮下，观察其生长;取实验和相应的正常鼠脾细胞进行细胞毒杀伤试验. 结果 BALB/c和CBA/N小鼠不成瘤;BALB/c nude和C.B-17SCID小鼠100%成瘤;SCID免疫重建组用BALB/c外周淋巴细胞重建SCID（BALB/c-PBL-SCID）的不成瘤，用CBA/N外周淋巴细胞重建的SCID（CBA/N-PBL-

2、SCID）成瘤，接种过瘤的BALB/c和CBA/N小鼠脾细胞对癌细胞有较强的细胞毒杀伤作用，对照组和nude，SCID小鼠无杀伤作用;SCID免疫重建有较小的杀伤作用. 结论 T细胞在异种瘤移植排斥中起主要的免疫杀伤作用，这种排斥是异种特异性的;肿瘤免疫需要综合性免疫作用. Keywords:hepatocarcinoma cell;vaccination;immunodefi-cient mice;T lymphocytes;cytotoxicity;flow cytometry Abstract:AIM To explore the effect of immune cells in va

3、r-ious mice with different immune on growth of human hepato-carcinoma cells in these mice and xenospecific cytotoxicity of these mice to hepatocarcinoma cells.METHODS The hu-man hepatocarcinoma cells cultured were inoculated subcuta-neous into the posterior limbs in various mice with different immun

4、e（including normal immune mice-BALB/c，B lympho-cyte deficient mice-CBA/N，T lymphocyte deficient mice-BALB/c nude and T，B lymphocytes combined deficient mice-C.B-17SCID）and their growth in the mice.Were surveyed And the spleen cells were harvested from both experiment groups in5weeks after being inoc

5、ulated and from control groups a to examine direct cytotoxicity to the hepatocarci-noma cells.RESULTS There were no carcinoma growth in BALB/c，CBA/N mice and immunoreconstructed SCID mice with BALB/c mice peripheral blood lymphocytes（BALB/c-PBL-SCID）but100%carcinoma growth in SICD，nude and immunorec

6、onstructed SCID mice with CBA/N mice peripher-al blood lymphocytes（CBA/N-PBL-SCID）.And the spleen cells in experiment groups of BALB/c and CBA/N mice dis-played strong cytotoxicity to target cells and the lymphocytes of immunoreconstructed SCID mice generated a little lysis of target cells，but those

7、 of control groups and nude，SCID mice generated no lysis of target cells.CONCLUSION Tlympho-cytes which are xenospecific cytotoxic mayplay a main role of immune killing in rejection to xenografted tumor but the com-prehensive immune may be necessary in the tumor immunity. 0 引言 肝癌是严重威协人类生命的主要肿瘤之一，因此对

8、肝癌的研究十分重要.肝癌的治疗除了早期诊断切除、介入导向、化疗、放疗外，免疫治疗及其基础研究仍十分重要1 .细胞免疫对肿瘤的排斥占有极其重要的地位，其中CD4+ 和CD 8+ 淋巴细胞都能识别肿瘤细胞，而CD 8+ 通过溶解作用能直接杀伤许多肿瘤，因此是抗肿瘤的主要效应细胞2 .CD4+ ，CD8+ 及NK细胞在同源肿瘤移植排斥中的研究有重要的意义3，4 ，异种特异性T细胞对肿瘤排斥作用的研究也占有重要的地位5，6 .我们通过将人类肝癌细胞系9724培养后接种到不同免疫力小鼠体内，观察肿瘤生长的差异性，测定CD4+ ，CD8+ 百分比例及细胞毒杀伤性，探讨免疫细胞对肿瘤生长的影响. 1 材料和

9、方法 1.1 材料 本中心建立的人类原发肝癌细胞系（HCC-9724）7 用含100mL L-1 小牛血清，10万U L-1 青霉素和10万U L-1 链霉素的RPMI1640完全培养液置37，50mL L-1 CO2 孵箱中培养，到一定数量的对数生长期时，用2.5mg L-1 胰酶（含2mg L-1 的EDTA）消化、离心、调整细胞数后接种到小鼠上.BALB/c小鼠15只，CBA/N鼠15只，BALB/c nude5只，皆为本中心繁殖的近交系或突变系实验小鼠，体质量1822g，68周龄，雌雄兼用.其中CBA/N，BALB/c nude小鼠三级实验动物BALB/c为二级动物.C.B-17SCI

10、D小鼠15只从解放军军事医学科学院动物中心提供的三级实验动物，体质量1518g，58周龄，用ELASA法检测无“渗漏”现象.全部实验小鼠都饲养在无特定病原体（SPF）条件中. 1.2 方法 BALB/c和CBA/N各分为2组皮下组，用于不同癌细胞数量的接种;BALB/c nude鼠和SCID只有一组皮下，每组5只.另外BALB/c和CBA/N各5只分别用于重建SCID小鼠免疫.在无菌条件下操作，摘除小鼠眼球取血，常规Ficoll密度法分离淋巴细胞，用RPMI1640洗涤两次（1500r min -1 ，10min），重新用RPMI1640悬浮，取1滴悬液与1滴2g L-1 台盼蓝染液混合，于计

11、数板上计数活细胞，调整细胞数21010 L-1 ，于接种瘤细胞3d前给SCID小鼠ip0.4mL.以癌细胞31010 L-1 接种各小鼠右后肢臀部皮下0.2mL（包括SICD免疫重建组）.因BALB/c和CBA/N小鼠没成瘤，又以11011 L-1 接种这两种小鼠右后肢臀部皮下0.2mL.SCID小鼠在接种瘤细胞前分别称重，各鼠接种癌细胞1wk后开始，每wk同一时间进SPF楼，观察肿瘤生长情况，长出瘤体用游标卡尺测量，体积根据公式V=ab2 /2（a-短径，b-长径）计算2 ，同时，SCID小鼠每wk称质量.5wk后处死，称瘤体质量. 1.2.1 小鼠脾细胞毒杀伤功能检测 鼠经脱颈处死，用75

12、0mL L-1 乙醇浸泡，在超净台中无菌取脾脏，研磨制成脾细胞悬液，洗涤后用100mL L-1 FCS RPMI1640调整11010 L-1 ，内加高剂量IL-2（10万U L-1 ）和经5Gy照射的肝癌细胞（1109 L-1 ），加到24孔培养板中，于50mL L-1 CO2 孵箱中培养诱导5d.取对数生长期的癌细胞1109 L-1 ，加N512 CrO4 3.7MBq于37孵育3h（每15min轻轻振 摇1次），取出用100mL L-1 FCS RPMI1640洗涤3次 （800r min-1 ，5min）重新悬浮，调整细胞数加入96孔培养板（每孔100L含1104 细胞），同时每孔加1

13、00L不同浓度的效应细胞，每份3个复孔，效靶比例为100 1，50 1，25 1，12.5 1.最大释放组加入10g L-1 TritonX-100100L，自然释放组加100L的完全培养液，在37CO2 孵箱中培养4h.然后每孔取上清液100L，于计数仪上测定cpm值，计算:特异性杀伤率（%）=（实验释放min-1 -自然释放min-1 ）/（最大释放min-1 -自然释放min-1 ）. 1.2.2 CD4+ 和CD8+ T细胞百分率测定 以31010 L-1 接种的CBA/N和BALB/c及正常相应鼠5wk后取血，置抗凝管中，用FITC标记的抗CD4+ 和CD8+ 抗体与全血混匀，室温下

14、放置15min后，用Qprep 自动细胞制备仪，加A，B，C液溶解红细胞和稳定淋巴细胞，再用PBS洗细胞1次，轻轻荡，立即上FCM（美国Coullter公司Profile型）检测，于波长488nm计数110 4 个淋巴细胞中各标记的T细胞数分数8，9 . 2 结果 2.1 小鼠癌体生长 以31010 L-1 接种小鼠皮下后，BALB/c和CBA/N鼠没出现癌细胞结节，而nude，SCID成瘤率达100%，且都随时间而增大;两种免疫重建SCID小鼠也有不同的癌结节表现，BALB/c-PBL-SCID癌结节到5wk全部消失，CBA/N-PBL-SCID3wk以后有逐渐缩小的现象（Fig1（略）.

15、最后所称的癌体质量均值为SCID组>nude组（P<0.05），SCID和nude组&CBA/N-PBL-SCID组（皆为P&0.01）.当用11011 L-1 癌细胞数接种到CBA/N小鼠后，出现癌体一时性增大，5wk时全部消失（Fig1（略）.还有另一现象，SCID小鼠的体质量随瘤体积增大而减小（Fig2（略），nude没有称质量），SCID和BALB/c-PBL-SCID小鼠癌体的大小与其各自体质量呈负线性关系（分别为r=-0.995，P&0.01和r=-0.953，P&0.05）.CBA/N-PBL-SCID癌体大小与其体质量没明显的负线性差异，但存在背离现象. 2.2 细

16、胞毒对肿瘤的杀伤 BALB/c和CBA/N的脾细胞对肝癌细胞系9724的杀伤有意义，在效靶比例100 1时，前者为（28.45.2）%，后者为（31.313.2）%（自然释放率约为8.5%）.CBA/N-PBL-SCID为（7.40.5）%，BALB/c-PBL-SCID为（6.40.6）%.SCID和nude小鼠只有微小的杀伤作用（Fig3（略）.不同小鼠的不同效靶比例对癌细胞杀伤线图如Fig4所示.相应对照鼠脾细胞进行试验时不产生杀伤效应. 2.3 CD4+ 和CD8+ T细胞 正常CBA/N小鼠的CD4+ 和CD8+ 数分数高于BALB/c，其中两组CD 4+ 之间有差异，CD4+ /C

17、D8+ 正常，接种肿瘤后发生变化（Tab1）.表1 CBA/N和BABL/c小鼠CD（略） 3 讨论 在肿瘤免疫中，认为T细胞起着最重要的作用，NK细胞在抗肿瘤及抗转移中起着不可忽视的作用3，4，10 .从肝癌细胞接种到4种小鼠所建模型看，具有T，B，NK三大免疫细胞的BALB/c小鼠排斥肿瘤最强;有T，NK细胞而B细胞缺乏的CBA/N小鼠排斥力仍很强，但随接种瘤细胞量增加，出现癌体增大又逐渐缩小至消退的现象.可见B淋巴细胞缺乏的CBA/N小鼠，排斥力仍强，然有所下降.尽管nude鼠有B淋巴细胞和NK细胞，由于缺乏T细胞已无法阻止肿瘤进行性生长增大.SCID小鼠是一种严重联合免疫（T，B细胞）

18、缺陷小鼠，NK细胞有所增高11 .本实验并没象文献3，10报道的那样NK有较强的排斥肿瘤作用，而是SCID瘤体比nude鼠癌体长得更快.免疫重建SCID小鼠的移植癌体的生长曲线说明免疫重建是成功的，也更证明了BALB/c和CBA/N免疫排斥肿瘤的特点.因而可推测，单独NK或B淋巴细胞的存在，或NK和B细胞同时存在都无法阻止肿瘤的生长，T细胞对肿瘤的排斥起最重要的作用，但并非B淋巴细胞和NK细胞不起作用.本组细胞毒杀伤实验基本符合小鼠免疫特点，更进步证明T细胞在肿瘤中的作用.正常CBA/N的CD4+ 和CD8+ T细胞百分率比BALB/c中的含量高，而本组CBA/N的脾细胞杀伤能力也高于BALB

19、/c，这与T细胞毒是一致的，也与另一文阐述相一致5 .BALB/c和CBA/N免疫重建SCID小鼠其细胞毒杀伤力较小，且前者高于后者，表明这一免疫重建是真实的，也符合该小鼠免疫特点，因为我们是通过ip进行免疫重建的.nude和SCID有微小的杀伤力并不能说结果与理论相矛盾，因诱导过程可激活NK至LAK细胞起到杀伤作用.非接种肿瘤4种小鼠脾细胞实验时无细胞毒杀伤力，这表明T细胞毒是特异性的. 另一问题是CBA/N中的T细胞百分率及杀伤力都比BALB/c高，而BALB/c对肿瘤的排斥力则大于CBA/N;nude鼠中B淋巴细胞的存在却对肿瘤没出现明显的抑制.因此，综合几种小鼠对肿瘤的排斥性及细胞毒性

20、作用，可以这样认为T细胞在直接杀伤肿瘤中起主要的作用，B淋巴和NK细胞也有排斥作用，但各种淋巴细胞和NK细胞不是简单的相加或相减，可能他们之间还存在着一种协同促进的作用;相反，一旦有一种缺乏，就会影响另一种细胞应有的作用.但也并非象有的作者认为，T细胞在抗肿瘤作用时，必需有共同刺激分子（如B7-1）的存在12 ，本文结果显示T细胞和B细胞都能单独发挥杀伤肿瘤的效应，可能是非B淋巴细胞依赖性T细胞杀伤作用或非T细胞依赖性的B淋巴细胞抗肿瘤. 那么T细胞对人类肝癌细胞的杀伤是特异性的免疫防御作用还是异种排斥作用?Sandrin等 13 认为异种移植的急性或超急性排斥反应主要由抗体和补体介导引起的;

21、虽然，淋巴细胞介导的细胞毒也参与异种移植非急性排斥反应，但主要由CD4+ 和NK细胞引起14，15 .具有穿孔素通路细胞毒的小鼠（如CBA/N，BALB/c等）针对人类肿瘤引起的细胞毒杀伤主要由异种特异性CD8+ 细胞介导的，是异种特异性T淋巴细胞的特异性免疫反应4 .本文接种癌细 胞和非接种癌细胞的细胞毒杀伤试验及肿瘤接种后 CD4+ ，CD8+ 的细胞含量的变化都证明T细胞毒的杀伤是异种特异性细胞毒免疫反应，也可推测是主要由CD8+ 细胞介导的，CD4+ 起辅助作用. 参考文献:1Wang J，Ma CL，Xin XY，Liu Yf，Sun C，Jin BQ.The clinical si

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