汇总整编包涵体的分离纯化Word格式文档下载.docx

1、但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪（现代分子生物学实验技术录象里的那种）很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loadingbuffer.loadingbuffer对于包涵体的溶解能力是较弱的. 取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE.这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体?而楼主的问

2、题,虽然loadingbuffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loadingbuffer是没有问题的.2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？在表达重组蛋白时，诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好，但是在裂解细胞时遇到问题。总是不能彻底裂解细胞。首先我采用超声裂解，可是不管我如何超声总有部分细菌没有裂解。我的超声条件如下：宁波新芝超声细胞破碎仪，功率400W，超5秒，间隔5秒，重复99次。然后显微镜观察，不彻底时再重复99次。菌体来自200ml培养液，用20mlPBS重悬。然后我又尝试加溶菌酶，首先加至终浓度100ug/ml，4C半小时菌液不变粘

3、，加大浓度至1mg/ml，半小时后仍无明显变化。因为我用的PBS是pH7.4，我怀疑是pH不合适，换用pH8.0TEbuffer，1mg/ml溶菌酶，4C半小时仍无明显变粘。因为这次使用的溶菌酶是前一天配好的，担心溶菌酶失效，重新称取冻干粉末，直接加入菌液，仍然没有明显变化。真是郁闷。到底出了什么事？请高手解答，并介绍优化的方案。同时希望能介绍一下如何选择细胞破碎方法，以及如何确定最佳条件。溶菌酶在pH7.4时是否没有活性了？可否配成浓缩液保存溶菌酶，如果可以，应如何保存？加入溶菌酶以后，如果细胞壁已破坏，菌液应该变粘吧，因为核酸被释放出来。而超声破碎细胞，我觉得菌液是不会变粘的，因为超声可以

4、把大分子核酸打碎成小片段。我判断细胞破碎不完全是因为，在将破碎后样品离心分离上清和沉淀跑SDS-PAGE观察，发现在细胞碎片组分中除了经常出现的一两条带以外，还有菌体总蛋白样品中的很多带出现。据此可以判断细胞只是部分破碎。不知我的分析是否正确，请版主和各位高手指教。如果溶菌酶效果还可以，我觉得先用溶菌酶初步裂解细胞，然后再用超声进一步破碎并断裂大分子核酸以降低粘度的细胞破碎策略可能比较好。因为超声有可能使蛋白变性，但单用溶菌酶不能确定是否完全破碎，还要再加核酸酶降低粘度。这种两步法策略应该还可以减少破碎条件优化的时间。我用的溶菌酶放置时间比较长了，有可能失活了。我刚从生工又定了一支，不过得后天

5、到货，但愿它有用。如何观察溶菌酶是否已裂解细胞，通过观察粘度变化是否可以？只反复冻融是否可以有效裂解大肠杆菌细胞？溶菌酶只有在pH值大于8.0的条件下才能发挥溶菌作用，请务必保持PBS的pH8.0，同时溶菌酶的量一定要足！在加入溶菌酶后，最好放于磁力搅拌器上搅拌30分钟，再进行超声破菌，我的超声条件是：功率400W，工作2秒，间隔2秒，重复199次。菌体来自500ml培养物，用30PBS重悬，超声效率还是可以的。哪儿的溶菌酶好用？我用生工的溶菌酶，称取干粉20mg。200ml菌液用18NaCl重悬，加入225mMTris-HCl（pH8.0），将溶菌酶干粉加入体系，混匀，测pH降低到56，加2

6、0ul2MTris碱，体系pH升到8。4C放置1小时，菌液上层变澄清，摇动发现体系没有变粘。测pH仍在8左右。再37C保温1小时，还没有变化，我简直不知如何才好了。另一瓶200ml培养物，溶菌酶处理1小时后超声。条件：300W，超5秒停5秒，重复99次。菌液有变化，但很不明显。继续超声400次，从外观来看没有太大区别。我简直要说tmd了。见鬼了。我的操作有什么地方不妥当，请各位指正。溶菌酶的厂商要求是否很重要？我的诱导物来自1：20过夜培养物接种，37C生长3小时后30C诱导2小时（0.8mMIPTG）。是否菌液太浓，Pharmacia的说明书200ml培养物用10ml重悬，我用20ml，仍然

7、不够稀？有人告诉我菌液应该稀一些，200ml用3040ml重悬。但实际操作也不够理想SDS-PAGE总是观察到细胞破碎效果不够彻底。超声那么多次，蛋白都要被超碎变性了。3、酵母的破碎 酵母是一类单细胞真菌的总称，其成员分别属于不同的真菌纲，细胞壁成分是否会有较大差别，这些都是做破碎酵母细胞前要考虑的。我归纳了一下，做破碎酵母的几种方法：1机械的方法：一般的PROTOCOL都是用glassbeads：如sigmaG-8772，加玻璃珠后超声，蛋白活性保持较好。2化学裂解的方法：10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状（希望高手点评） 3尿素裂解液（尿素8mol/L,NaCl0.5mol/L

8、,Tris20mmol/L,EDTA2%SDS,PH值8.0）高压匀浆。（这个好象也该在方法2中） 4液氮冻融并研磨酵母破壁，我认为这种可能在小试中比较合适。5温和的酶法，可能不会会破坏酵母原生质体 酶法裂解主要用两种酶：1。蜗牛酶，可以直接从蜗牛的胃液中获得；2。lyticase，可以从sigma定购。这两种酶解法都可以和上面的几种方法结合使用，尤其是glassbeads方法，效果很好。我用过化学裂解的方法，10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状。此法的裂解效果不错的，不妨试一下。一篇文章是加尿素裂解液（尿素8mol/L,PH值8.0），据说效果可以 酵母破碎效果好的我所做过的方法中

9、还是玻璃珠，就象microbe和rongjunli所说的那样，效率很高的，而且对目的蛋白活性不会有什么影响。一般应该用这个方法。4、超声破碎的条件选择 超声破碎的条件不能一概而论，要看你的实验要求，有的是细菌破碎，有的是对组织细胞进行破碎，要掌握好功率和每次超声时间，功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，必要时在冰浴条件下进行超声破碎。至于每次超声时是否起泡沫到不是关键的问题，这与你超声的量明显有关。5、如何鉴定细菌超声破碎的程度最简单的方法：涂片-革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟-显微镜观察 切记：只用结晶紫染色，别忘了染色后再用水稍冲洗一下6、细菌裂解的DNaseI 不同纯度的酶换算

10、标准不同，所以你最好查查是哪个公司的酶？仔细看说明书，可能会有换算说明。另外看一下参考文献所用的酶是哪个公司的，到该公司的主页也可能有收获。我用过华美和TAKARA的DNA酶，华美的是用mg/ml。华美也有RNasefree的DNA酶，定量用活性单位。TAKARA的两种酶都是用活性单位定量的。我在超声裂解细菌时加入一些DNA酶，一般用超声液加不同量的酶做一个预实验，选取符合你需要的酶量。其实根据目的和方法的不同，所需要的酶量也是可调节的，比如酶切温度（16度或37度）。7、超声裂解细菌是否完全？只用结晶紫染色二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，

11、先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。包

12、涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50mMNaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3mM。去垢剂如TritonX-100、脱氧胆酸

13、盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白OmpT（37KDa）在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故

14、目前已被广泛采用。盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实验际温度要比设定温度低至少4度（呵呵，不好意思！）。不过我接着往下进行SDS-PAGE、层析

15、等发现没有什么不良影响。所以，你不用担心也许你的蛋白也只是和你开了个玩笑呢！三、关于包涵体的溶解：1、请教GST包涵体溶解直接用8M的脲或6M胍融解，取上清，测浓度。直接稀释后包被检测相应抗体。（由于快速稀释相当于复性过程，产物用于检测没有问题的）我所用的包涵体提取方法：1PBS或生理盐水洗涤诱导后菌体，BufferA重悬菌体，超声波破碎至清亮 度，rpm离心分钟，弃上清 用或生理盐水洗涤沉淀次 往沉淀中加mlBufferA及ml的（十二烷基肌氨酸钠）贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温静置分钟至小时 度，rpm离心分钟，取上清 加ul至终浓度为，加mM的氧化型谷胱甘肽ul至终浓度为mM,加1

16、00mM的还原型谷胱甘肽ul至终浓度为mM,静置分钟至小时（亦可度复性过夜） 以（pH8.0）或（pH8.0）透析，取出度保存备用 ！A配方：Tris-base50mM 0.5mM 甘油5% DTT5mM2、包涵体的溶解 十二烷基肌氨酸钠与十二烷基肌氨酸在溶解包涵体时，可不可以互相代替？可以替换，调pH不久没什么区别了吗；两者的功能团相同，pH不同，前者钠盐便于保存罢了 3、有关包涵体的溶解问题强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl6M），是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿

17、素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等是去垢剂，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。4、8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存?我在4度放了半个月，目前没出什么问题5、8M尿素溶解的包

18、涵体溶液在室温下可以放多久而不出现问题?BI溶液在室温放置48小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，因而早些处理BI溶液比较好。具体有什么影响我也不是很清楚。6、GST融合蛋白形成包含体不溶，咋办？GST融合蛋白应该不能用尿素等作用太强的变性剂，否则GST融合蛋白是不能与beads相结合的GST的Beads是应用酶与底物结合的原理，所以要去除处理因素后才好结合，不知你的温和的去污剂是什么？做完裂解之后加TritonX100轻摇min，蛋白溶解的会多些！四、包涵体的复性 1、包涵体如何复性 包涵体的复性主要有两种方式：1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释

19、2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂 其中透析很适合实验室应用，但是时间长。另外，如果蛋白质右两个以上的2硫键，很可能错误形成配对，应用还原剂。还有，复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确定！另外，你用多大体积的透析缓冲液？可能不够，要更换几次 你家了多少蛋白呀？蛋白量过大也会使复性困难。你用的透析代是否是新的，处理过没有？新代有化学杂质！最后，有些复性过程就是还有沉淀（透析方法的缺点）看看溶液中蛋白含量，说不定已经够用了 包涵体的复性还要注意以下几点：1.首先要获得较高纯度的包涵体。2.包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。3.透析前后均要离心 4.透析不

20、能太快. 5.纯化的最佳条件要摸索。小技巧：1）包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100. 2）包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性 3）复性液的组成很有讲究，本人使用OxidisedGlutathione/ReducedGlutathione还加入一定的L-Arginine-Hydrochloride12-24h 4）复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h 5）复性率的测定据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定（望有经验的战友能更详细地讲解）6）TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。好像SDS最后残留量不能大于0

21、.5%吧，忘了。我用Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就很方便了。因为色谱柱的纯化条件比较难optimize。这段文字可以参考：用Novagen公司pETSystemManual提供的方法，分别进行细菌渗透休克，超声波裂解，研究融合蛋白在细胞周质，细胞质和包涵体中的分布。渗透休克用1.2.3方法诱导细菌（10ml体积），测菌液OD600，10000r/min离心0.5min去上清，加入渗透休克溶液1（V1=OD600V2/5，V1为渗透休克溶液1，V2为培养新鲜菌液），冰浴1

22、0min，10000min，去上清。加V1体积渗透休克溶液2重悬，摇动冰浴10min，保存上清、细菌沉淀。作如下处理：上清用三氯乙酸（TCATrichloroaceticacid）沉淀，加1/10体积100%TCA（w/v），涡漩15sec.，冰浴10min，13000r/min离心5min，100ul丙酮洗涤沉淀，干燥1h，加V1/2体积1PBS（pH10）溶解，-20保存，取10ul加入等体积2SB，进行12%SDS-PAGE电泳分析，UNIUERSALHooD-S.N.75s成像系统照相。超声波裂解细菌渗透休克细菌沉淀加1/10培养体积20Tris-HCl（pH7.5，0）重悬，冰浴，超

23、声波裂解，20%工作选择，脉冲粉碎1min，然后13000min，-20保存上清、细菌沉淀。上清进行TCA沉淀，处理同上。沉淀用ProteinExtractionReagent（Ni-NTAHiBindPurificationKitBugBuster.提供）按Novagen公司pETManual提供方法反复处理，洗涤包涵体。包涵体按培养菌100OD600/3ul体积加1%SDS溶解，加等体积2SDS-PAGE电泳分析，进行蛋白条带灰度扫描，计算融合蛋白Trx-PrPC27-30占细菌总蛋白的相对含量。1.2.7重组融合蛋白的纯化 PrP-pET-32a（+）转化表达菌E.coliBL21（DE

24、3），TB培养基中，25，AMP200ug/ml，摇床（250rmin）培养至OD600约为1.5，更换等体积新鲜TB培养基，加入IPTG至终浓度1mM，AMPug/ml，25，4h，4000g离心收集菌体。按Ni-NTAHiBindKit使用说明溶解包涵体，纯化融合蛋白。或使用笔者改进方法，将Ni-NTAKit使用说明中BufferD改成Wash-Buffer，Buffer-E改成Elute-Buffer，最后用Buffer-E重生Ni-NTARasin，Binding-Buffer平衡以后加50%酒精保存，以免长菌。洗脱所得蛋白用TCA沉淀，处理同上，得融合蛋白Trx-PrPC27-30，

25、冻干保存。然后12%SDS-PAGE凝胶电泳分析。3、包涵体复性2 精氨酸可助溶，但精氨酸是代谢产物高浓度对人可能不好。另外甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以试一试。对于疏水蛋白的可溶表达，可以降低诱导温度（可以试试4度诱导过夜）和IPTG的量，降低蛋白的表达速度，从而减少包涵体形成的速度，增加正确折叠蛋白的量。或者换成GST融合表达载体，GST可以增加后面融合蛋白的可溶表达。我的蛋白包涵体在经变性纯化后透析复性过程中，在透析液中加入了1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶效果。我想对于你的情况，由于含有二硫键，还要加入一定比例的谷胱甘肽，才能形成正确的二硫键。复性是一

26、个很难捉摸的过程，不同蛋白的复性条件也各不相同。5、包涵体复性问题包含体复性三大原则：低浓度 平缓梯度 3。低温 有蛋白析出最大的可能型是：蛋白浓度太高，建议你稀释以后再作透析。此外，透析的盐浓度（比如ura）要平缓降低：8m-6m-4m-2m-pbs-H2O。6、包涵体复性形成聚集物 关键是蛋白在复性过程中凝聚了以后，调节PH可以使其溶解，但是这样复性好的蛋白有没有活性还是问题，虽然样品溶解了，但活性不高或没有也不行呀！7、复性中蛋白析出！出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法，例如根据你包含体的溶液成分，每隔1个PH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。若加变性剂尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M；另