蛋白质间相互作用研究方法技术流文档格式.docx

1、细胞，使它们在新鲜的CM（Glu）-Ura-His或CM（Glu）-Ura平板上划1 cm长的线，30孵育过夜。6第二天，从两个母板上再划线到下列每个板上：转化af：划线到CM（Glu, X-gal）-Ura和CM（Gal, X-gal）-Ura上 转化ac：划线到CM（Glu）-Ura-His-Leu和CM（Gal）-Ura-His-Leu上 730将平板孵育到4天。8对抑制和激活性进行分析：a. 对于抑制活性，在划线接菌1224 h时观察X-gal表型。b. 对于激活性，在划线接菌1872 h时观察X-gal表型。c. 在4896 h之间观察Leu表型。9基于抑制和激活分析的结果，选择适当

2、的候选克隆。检测诱饵蛋白质表达 10 在母板上，标记要分析蛋白质表达的克隆。用已证实适宜表达诱饵的克隆作为基础菌培养，供文库转化用。11 对每个新的诱饵构建，至少分析两个初级转化子。还要包括两个作为蛋白质表达阳性对照的转化子。12 转移1.5 ml培养液到一个微量离心管中，在离心机上以最大速度离心细胞35 min。可见沉淀的体积25l。小心倾去或吸除上清。13 加入50l的2SDS凝胶加样缓冲液到离心管中，快速振荡离心管以悬浮沉淀。立即将离心管放在干冰上或干冰/乙醇浴中。14 将样品从干冰或-70直接转到100，并煮沸5 min。15 将样品在冰上冷却并在离心机上以最大速度离心530秒。加20

3、50l样品到SDS聚丙烯酰胺凝胶的每个泳道中。16 电泳并分析产物以确定预期大小的诱饵蛋白是否以合理的水平表达。17 为防止可能出现的问题，通过免疫印迹来分析含LexA融合的诱饵的酵母裂解液。第二阶段：筛选一个相互作用子 转化文库 1 挑选一个在第一阶段的原始对照试验中状态最好的表达诱饵蛋白和lexAop-lacZ报道子的酵母菌落，接种于20 ml CM（Glu）-Ura-His液体培养基中，30摇动过夜培养。2 稀释20 ml的过夜培养物于300 ml的CM（Glu）-Ura-His液体培养基中至OD600约为0.100.15。在旋转摇床上30摇动培养，直到OD600达到0.50左右。3 把

4、培养物转移至1个250 ml的无菌离心瓶中，室温下10001500g（使用Sorvall GSA转子25003000 r/min）离心5 min。移去上清，加入30 ml无菌水，在工作台上轻轻拍打离心瓶重新悬浮沉淀，转移混合物至1个50 ml的无菌Falcon管中。4 10001500 g（同上）离心酵母细胞5 min。倒掉水，重新悬浮酵母细胞于1.5 ml含0.1 mol/L乙酸锂的TE（pH 7.5）中。5 在30个1.5 ml的无菌小离心管中分别加入1 g的文库DNA和50g刚刚变形的载体DNA。马上在每个小离心管中加入50l的酵母悬浮液。6 在每管细胞悬浮液中加入300l含40% PE

5、G4000和0.1 mol/L乙酸锂的无菌TE（pH 7.5），混合（不要振荡），30培养3060 min。7 每个试管中加入40l DMSO，翻转混匀悬浮液，在42的加热块上加热10 min。8 转化混合物铺平板：其中的28管用于产生转化子：把每管混合物加到24cm24cm的CM（Glu）-Ura-His-Trp选择平板上，将细胞涂匀，将板30孵育至菌落出现。剩余2管：每管取350l混合物加到24cm24cm的CM（Glu）-Ura-His-Trp选择平板上，30培养平板至出现菌落；吸取每管剩余的40l混合物用无菌的TE（pH7.5）或水做一系列的1：10稀释，每份稀释液取100l取在100

6、 mm CM（Glu）-Ura-His-Trp平板上，30培养平板至出现菌落。初级转化子的收获和富集 9 通过摇动法或刮擦法收获文库。10 如果需要，在每个装有酵母细胞的锥形管中加无菌TE（pH7.5）或无菌水至4045 ml，振荡或翻转试管悬浮细胞。11 使用台式离心机1 0001 500g室温下离心试管5 min，弃去上清。12 重复步骤10和11。13 重新悬浮压紧的细胞沉淀于一倍体积的无菌甘油溶液中，合并不同管的内容物，彻底混合。14 分别转移1 ml的细胞混合物于一系列无菌小离心管中，-70冻存。相互作用蛋白的筛选 15 解冻一份转化文库酵母细胞（来自步骤14），用CM（Gal-Ra

7、ff）-Ura-Trp培养基按1：10稀释，30摇动培养酵母细胞4 h来诱导文库中GAL1启动子的转录。16 在适当数量的100 mmCM（Gal-Raff）-Ura-Trp-Leu dropout平板上分别培养106个细胞。17 30培养平板5天。18 观察平板的生长，出现克隆时对其加以标记。19 第5天，形成一个按每天出现的不同克隆分组的主板。20 30孵育平板直到斑点/菌落形成。阳性相互作用的初次确定：-半乳糖苷酶活性和亮氨酸需求的检测 21 测定转录活性。22 解释结果。第三阶段：阳性相互作用的再次确定 阳性质粒的分离 1从阳性菌落中制备细胞裂解物：分离少量的菌落时，将细胞在SDS中裂

8、解；分离大量的菌落时，细胞用酶解酶裂解。转化至大肠杆菌中 2通过电穿孔的方法在感受态大肠杆菌DH5或菌KC8中引入15l的质粒DNA制备品，把细菌铺在含有50g/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上，37孵育过夜。3如果质粒DNA转入DH5中，则进行步骤4，如果转入KC8，则：在LB/氨苄青霉素瓶板上重新划线培养，或复制平板将菌落转移至细菌用基础培养基，37孵育过夜；从一个分离的菌落制备小量的DNA，按步骤2所述利用这些DNA转化细菌DH5细胞。4从携带文库质粒的DH5细胞制备小量的DNA。5通过对含有相同插入片段的阳性克隆制备的重复样品来进行限制性酶切分析确证或确定是否重复分离到了小量的cDNAs。

9、阳性相互作用的第二次确证：重复表型和特异性检测 6用下面的几组质粒转化酵母株EGY48，在CM（Glu）-Ura-His平板上筛选菌落。a. pMW112和pBait b. pMW112和pRFHM-1 c. pMW112和一个非特异性诱饵蛋白 72至3天后就可以使用由步骤6所得的转化酵母。使用电穿孔的方法把得自大肠杆菌KC8和DH5的质粒引入单个的转化子ac中。把转化混合物铺在CM（Glu）-Ura-His-Trp平板上，30孵育平板直至菌落长出。8为每个需要检测的文库质粒制作一块CM（Glu）-Ura-His-Trp主板。9如第2阶段步骤21所述，检测-半乳糖苷酶活性和亮氨酸营养缺陷型。1

10、0 分析这些特异性检测的结果，并对所得阳性分离物进行测序。. 用GST融合蛋白进行Far Western印迹来检测蛋白质-蛋白质相互作用 放射标记蛋白探针的制备 1在微量离心管中制备下列反应混合物：-32P ATP（6000 Ci/mmol） 5l 蛋白激酶A 1 unit/l 在谷胱甘肽琼脂糖上的GST融合蛋白 13g 2PK缓冲液 12.5l 水 到25l 反应混合物在37孵育30 min。2标记反应完成后，加入200l的1PK缓冲液到离心管中清洗琼脂糖珠，然后在微量离心机上以最大速度离心1 min。用适当的方式将含游离放射性核酸的上清弃去，再重复清洗一次。3用一种蛋白酶切下标记蛋白质，或

11、用20mmol/L还原型谷胱甘肽于50mmol/L Tris （pH8.0）中，将标记GST融合蛋白从琼脂糖珠上洗下。将标记蛋白存放在冰盒中，在同一天中使用。4在标记反应前如果标记蛋白与GST成分分开，就将标记蛋白上用1PK缓冲液平衡的Sephadex G-50柱，以除去游离的标记核酸。探针蛋白一旦与游离核酸分开，就可使用。将标记蛋白放在冰盒中，在同一天使用。探测膜 5用标准技术将蛋白质转移到膜上，制备待检测的膜。6用碱性缓冲液完全覆盖膜并在4轻轻振荡清洗10min。7弃去碱性缓冲液，用封闭缓冲液完全覆盖膜，并在4轻轻振荡孵育4 h过夜。8加入13g的贮存探针（步骤3，4）到足够的相互作用缓冲

12、液中，使终浓度为15 nmol/L，制备标记蛋白溶液。将膜转移到含稀释探针的平皿中，确认探针溶液与膜的整个表面均匀接触。4轻轻振荡孵育4 5 h。9以适当的方式弃去放射性探针溶液。用磷酸缓冲盐溶液（含0.2% Triton X-100）完全覆盖膜，并在4轻轻振荡孵育10 min。重复洗涤3次。10 用磷酸缓冲盐溶液（含0.2% Triton X-100和100 mmol/L KCl）完全覆盖膜，并在4轻轻振荡洗涤10 min。重复洗涤1次。11 用塑料包膜小心包裹膜并曝光到X光片上。相互作用在生理上的证实和探索 . 通过免疫共沉淀确定结合蛋白 1用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细

13、胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。2将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4以最大速度离心15 min。3收集上清（约30 ml）并加入30g的适当抗体，4摇动免疫沉淀物1 h。4加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，4摇动免疫沉淀物30 min。5用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次。6吸出混合物的液体部分。加入800l的1SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min。7将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜。8通过考马

14、斯蓝染色观察蛋白质泳带。9从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min。10 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。11 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。快速分析过去已确定的相互作用 . 利用BIAcore通过表面胞质基因共振光谱学分析相互作用的蛋白质 RAMc通过伯氨基与CM-5传感芯片表面的结合 1将CM-5传感芯片模块嵌入BIAcore仪器。2全部采用过滤并除气的HEPES缓冲盐溶液。3将分别含有NHS、EDC、乙醇胺和RAM Fc以及20 mmol/L HCl各100l的小管置

15、于BIAcore自动进样器架的适当位置。4将一个空管置于BIAcore自动进样器架上。5开动仪器，以5l/min的流速流过一个流动池。6将75l的NHS加入到一个空管中。7在同一个管中再加入75l的EDC。8将含有NHS和EDC的小管中的成分混匀。9注射35l NHS/EDC混合物使表面活化。10 注射35lRAM Fc到活化表面与抗体结合。11 注射35l乙醇胺使过量的反应基团失活。12 快速注射10l的20 mmol/L HCL，然后用Extraclean除去非共价结合型材料。13 通过在开始注射RAMc前放置一个基线报道点，并在注射20 mmol/L HCl结束后2 min放置第二个报道

16、点，来测定结合RAMc水平。14 关闭流动液，关闭命令窗口，保存报道文件。检测抗-TSH与RAMc表面的结合 15 开动仪器，使含有结合RAMc的流动池流速为10l/min。16 注射10l的2g/ml抗-TSH。17 快速注射10l的20mmol/L HCl，然后用Extraclean再生RAMc表面。18 为了测定结合到RAMc表面的重现性，用可以与抗TSH结合引起250 Rus所需的体积重复注射抗TSH。19 快速注射10l的20 mmol/L HCl，然后用Extraclean再生RAMc表面。20 关闭流动液体，关闭命令窗口，保存报道文件。检测TSH与捕获抗-TSH表面的结合 21

17、开动仪器，使含有结合RAMc的流动池的流速为10l/min。22 注射10l的2g/ml抗-TSH。23 注射25l的200 nmol/L TSH，限定120 s的解离时间。24 快速注射10l的20 mmol/L HCl，然后用Extraclean再生RAMc表面。25 关闭流动流，关闭命令窗口，保存报道文件。蛋白质相互作用的检测 免疫共沉淀（Co-IP）：细胞内的蛋白质蛋白质相互作用研究 GST/His-pull dowm：体外的蛋白质蛋白质相互作用研究 Far-Western 用western方法对转移到膜上的蛋白质或直接在电泳胶上进行蛋白质相互作用分析，结合化学发光检测技术。一、酵母双

18、杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白

19、基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。三、等离子共振技术 表面等离子共振技术（Surface Plasmon Resonance，SPR）已成为蛋白质相互作用研究中的新手段

20、。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。四、荧光能量转移技术 荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法

21、，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。五、抗体与蛋白质阵列技术 蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路。蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变，微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，他也是芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经应用再眼就的各个领域里。六、免疫共沉淀技术 免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相

22、互作用的一种技术，其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA），若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白兴趣蛋白抗兴趣蛋白抗体SPA|Pansobin”，因为SPA|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷：一是两

23、种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。七、pull-down技术 蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免疫共沉淀（Co-IP） 、Pull-down技术或Far-western法研究。Pull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。