基因工程期末复习整理Word文件下载.docx

1、4、比较在细菌、真核细胞和动物个体中表达外源基因的优缺点？动物：优点：目的基因在哺乳动物细胞中表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白，哺乳动物细胞能以悬浮培养或在无血清的培养基中达到高密度且培养体积能达到1000L 以上 缺点： A、哺乳动物细胞的表达水平低 B、高表达细胞株构建复杂 C、细胞大规模培养工艺复杂 D、哺乳动物细胞生产的蛋白质类药物的成本较高第三章 基因工程常规技术一、名词解释1klenow fragment：DNA聚合酶被枯草杆菌蛋白酶水解后产生的大片段，具5 3聚合酶活性和3 5外切酶活性，是分子生物学中的重要工具。2Taq酶：水生栖热菌

2、（Taq）中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。3核酸酶S：来源于米曲霉素（aspergillusoryzas），作用于ssDNA和ssRNA。4末端转移酶：terminal transferase，来源于小牛胸腺。是仅存于前淋巴细胞和淋巴样细胞内的一种不同寻常的DNApol，催化dNTP加到DNA分子3OH末端。5碱性磷酸酶（AKP/ALP）：同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。每个单体由449个氨基酸组成，同时每个单体均具有一个活性中心。是能够将对应底物去磷酸化的酶，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。包括BAP（细菌碱性磷酶）和CIP（小肠碱性磷酶）。6Pla

3、smid：质粒，是细菌染色体外的闭合环状的双链DNA分子，主要有F质粒（F因子或性质粒）、R质粒（抗药性因子）、Col质粒（大肠杆菌素因子）。7表达载体：具有克隆载体的基本元件，还具有转录/翻译所必需的元件的载体。为了有效的转录，必需有强大的启动子和终止子，为了实现翻译，克隆基因必需有合适的SD（RBS）8穿梭载体（shuttle vector）：能在两种宿主生物体内复制的载体，可以运载目的基因穿梭往返两种生物之间。9MCS：多克隆位点，指质粒上的一段DNA，其上包括一序列限制性内切酶位点，以利于外源DNA的插入。10Cosmid：黏粒，柯斯质粒。一种由质粒和噬菌体联合构建的新载体。黏粒的基因

4、组包括以下部分：质粒复制原点、多克隆位点、抗药性基因和噬菌体两端的cos位点。11YAC：酵母人工染色体。利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体，克隆能力为200-2000kb。YAC载体含有的着丝粒,端粒和复制起点三种成份可以满足YAC自主复制，染色体在子代细胞间分离和保持染色体稳定的需要。YAC以环状方式存在，具有大肠杆菌质粒的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。12脉冲电场凝胶电泳：DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。该方法可分离长至5Mb的DNA分子。13RT-PCR：反转录PCR，由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作“逆转录”，由依赖RNA的

5、DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。14RACE：cDNA末端的快速扩增。利用PCR技术在已知部分cDNA序列的基础上特异性克隆其5或3端缺失序列的方法。15差异显示：利用一系列的oligo（dT）引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA，通过PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因。16Real-time PCR:实时定量荧光PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针

6、，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。17基因组文库：从某种生物体中分离出完整的染色体DNA，并且用限制性内切酶消化到所需的平均长度，连于相应的载体，构建而成。18.cDNA文库（ cDNA Library ）：含某种细胞特定时间所有的mRNA经逆转录产生的cDNA与相应载体（质粒或噬菌体）连接后，得到的重组克隆的总和19.滴度：病毒悬液的浓度，可用pfu（噬菌斑形成单位）表示。如每微升的噬菌斑形成单位（pfu/L）。 20.差减cDNA文库：差减文库也称扣除文库，对存在差异表达的两种材料提取mRNA （或反转录后合成cDNA），用大大过量不含

7、目的基因的一方作为驱动子（Driver）与含有目的基因的试验方（Tester）进行杂交，选择性的扣除两部分共同基因杂交形成的复合物，将含有目的基因的未杂交部分收集后，并连接到载体形成文库。21.Southern blotting：Northern blotting：都为核酸分子杂交技术。探针与待测核酸序列之间的杂交。指将核酸转移至固相载体（能吸附核酸的滤膜或滤纸），用探针（酶或同位素等标记的核苷酸片段）去反应，从而实现对核酸进行分析和鉴定的技术。不同的是，Southern 杂交的对象是DNA。另一个是RNA。22.缺口平移法：有DNase，Pol，标记dNTP。23.原位杂交（in situ

8、hybridization，ISH）：探针直接与细胞或者组织中的核酸进行杂交，DNA的变性、杂交和检测等都在载玻片上进行，如菌落杂交、噬菌斑杂交、染色体杂交、组织切片原位杂交、整胚原位杂交。如果探针是由荧光底物标记，最后的检测可以通过荧光显微镜进行直观观察，称为荧光原位杂交。24.FISH（fluorescence in situ hybridization）：荧光原位杂交技术，是将DNA（或RNA）探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。

9、25.基因芯片（DNA microarray）：又称DNA 阵列（DNA array），在玻片、硅片、薄膜等载体很小的基质表面上有序地、高密度地排列、固定了大量的靶DNA片段或寡核苷酸片段，形成了高密度的DNA微阵列。二简答题1.基因工程发展过程中标志性的事件有哪些？1）发现DNA连接酶2）分离限制性内切酶与逆转录酶3）体外DNA重组技术的建立和基因工程的诞生4）DNA测序技术5）Ti质粒作为植物基因工程的载体6）PCR技术的发明2.基因工程的基本原理是什么？在DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液（Mg2+）的混合物中，在耐高温DNA聚合酶的催化下，对一对寡聚核苷酸所界定的DNA片段进行扩增

10、。这种扩增是通过模板DNA与引物之间的变性、退火（复性）、延伸三步反应为一周期，循环进行，使目的DNA片段得以扩增。3.简述作为基因工程载体应具备的条件。1）具有一个或多个限制酶切点，以供外源基因插入其中;2）具有标记基因，以鉴定重组是否进入受体细胞;3）能自我复制，否则可能导致重组丢失;4）对受体细胞无害;5）大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大不便操作。4.基因中常用的抗性标记有哪些，工作原理是什么？抗性标记基因编码原理Ampr酶水解-内酰胺环，解除氨苄的毒性tetr1个膜蛋白阻止四环素进入细胞camr乙酰转移酶生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性neor（kanr）氨基糖苷磷酸转

11、移酶使G418（卡那霉素衍生物）转移酶失活hygr潮霉素磷酸转移酶使潮霉素失活5.质粒DNA的分离提取和纯化的方法有哪些，原理是什么？提取方法：方法碱裂解法在碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA的氢键断裂，致使宿主染色体DNA变性，但闭合环状的质粒DNA由于拓扑缠绕而不能彼此分开。当以pH 4.0的NaAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，质粒DNA迅速恢复原有的构型，重新形成超螺旋分子，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。（小量制备质粒DNA） 煮沸法沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配对，并使宿主细

12、胞的蛋白质与染色体DNA变性，但CCC质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下降后，CCC质粒DNA可重新恢复其超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清中的质粒DNA。（对于某些特殊的质粒，只能用煮沸的方法进行提取）还有酚氯仿裂解法、SDS法、 羟基磷灰石层析法等常用的纯化方法有柱层析法，和氯化铯梯度离心法，二者都利用了质粒DNA 相对较小和共价闭合环状这样两个性质。具体的氯化铯梯度离心法原理是：溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加， 从而阻止了溴化

13、乙锭分子的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多溴化乙锭，直至达到饱和（ 每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子） 。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。6.蓝白斑筛选（互补筛选）的基本原理是什么？MCS处具有半乳糖苷酶N端编码基因（lacZ），宿主菌具有该酶的C端编码基因，二者结合能够分解底物X-gal，产物使菌落显蓝色。当目的基因插入MCS时， lacZ失活，无互补现象，菌落为白色。7.噬菌体载体如何从噬菌体改造而来？与质粒载体相比有何特殊用途？去除噬菌体上的编码溶原生命周期的非必须序列和一些限制性内切酶位点，加入多克隆位

14、点、某些筛选标记基因构建而成的载体。可将外来目的DNA替代或插入中段序列（包装范围35-51 kb），使其随左右臂一起包装成噬菌体。与质粒载体相比具有转化效率高、可以容纳长的外源DNA、可将外源DNA整合到细菌的基因组上等特点，适合建库。类型：包括插入型载体、置换型载体。8.简述M13噬菌体的特点和在基因工程领域的用途。 M13噬菌体是lacZ筛选标记和MCS与M13噬菌体基因组进行重组而形成的载体，既能象质粒一样复制，又能产生单链DNA，用于DNA测序，体外定点诱变等。9.限制性内切酶有哪些类型：基因工程常用的是哪一或几类？限识别特定的DNA序列，在一定的条件下切割双链DNA。可分为、三类：

15、I类和类在同一蛋白分子中兼具甲基化和内切酶活性，识别和切割位点不固定；II类酶是基因工程中主要的工具酶。10.限制性内切酶有哪些特点？1）识别双链分子的某种特定核苷酸序列2）使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开11.YAC为何能用于建立基因文库？YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。12.试比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶（PAGE ）：

16、普遍用于蛋白质和小分子核酸分析。分辨DNA范围：1-1000 bp。琼脂糖凝胶：孔径较大，对蛋白质不起分子筛作用，一般用于DNA的分析。0.1-60 kb。相同点就是样品都是带负电荷的，从负极向正极移动，移动的距离都和样品的分子量有关。13.核酸染色的方法有哪些？各自的原理是什么？溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光银染银染色液中的Ag+可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA回收复杂SYBR Green I 染料与DNA小沟结合（而EB则

17、是嵌入到碱基之间） ；最大激发波长497nm，最大发射波长520nm；高灵敏度，较低毒性；结合双链DNA分子后荧光增强800-1000倍14.简述PCR技术的基本原理。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚

18、合酶将脱氧单核苷酸加到引物3-OH末端，并以此为起始点，沿模板53方向延伸，合成一条新的DNA互补链。15.Real-time PCR分基本原理是什么？在基因表达分析方面有何优点？1）全封闭PCR，无需跑胶，无需后处理；2）增加精确性，实时监测，直观看到反应的对数期；3）引物和探针同时与模板特异结合，降低反应的非特异性；4）结果分析快捷方便。16.Real-time PCR所使用的标记方法有哪些类型？1）SYBR荧光染料：2）TaqMan荧光探针：3） Molecular beacon分子信标探针：17.分离基因常用的方法。类型常用方法用途质粒DNA DNA重组基因组DNACTAB法基因克隆

19、、文库构建、遗传多态性分析总RNA胍盐法 RT-PCR克隆基因、Northern Blotting18.外源基因导入宿主的方法有哪些。物理法：DNA直接注射法；颗粒轰击技术化学法：即用化学方法构建非病毒载体系统，借之完成基因转导。有脂质体载体法和受体介导法生物学方法：主要通过构建病毒载体来完成。有腺病毒（Adv）、单纯疱疹病毒（HSV）、腺相关病毒等。19.基因组文库的构建的基本步骤有哪些？（1）基因组DNA的提取破碎细胞，抽提蛋白，沉淀核酸。（2）基因组DNA的片段化用限制性内切酶Sau3A（识别4碱基）对基因组DNA进行部分酶切，能得到相对较长的DNA片段。回收20 kb左右大小的片段。（

20、3）DNA片段与载体连接DNA片段与用BamH（与Sau3A为同尾酶） 消化的置换型噬菌体载体臂进行连接，构成重组DNA分子。（4）重组分子的转化与筛选重组DNA分子与包装蛋白混合，就能够自动完成包装过程，形成完整的、具有很强感染能力的噬菌体颗粒。20.简述cDNA文库构建的基本步骤。（1）mRNA的制备提取总RNA，亲和层析纯化出mRNA。（2）cDNA的合成mRNA逆转录成cDNA，合成双链cDNA。（3）双链cDNA与克隆载体连接双链cDNA接上接头，插入载体，构成重组DNA分子。21.cDNA的合成有哪些方法？cDNA第2条链的合成方法置换法：第一条链合成完成后，用RNaseH降解杂交

21、分子上的mRNA链。利用降解后的小片段作为引物，大肠杆菌聚合酶合成第二条链，片段之间的缺口由连接酶连接，形成完整的cDNA第二条链。这种方法应用较广，因为它能得到较完整的mRNA信息。自身引导法：逆转录酶体外合成DNA链结束前，DNA链会自己折转回来几个核苷酸形成一个发夹结构。DNA聚合酶的Klenow片段从发夹结构的末端开始合成DNA链，反应完成后，用RNaseH降解RNA链，用S1核酸酶（专门切割单链DNA）打开发夹结构。用S1核酸酶对发夹结构进行切割会导致部分cDNA序列信息的丢失，因此这种方法应用较少。22.基因芯片的基本原理和用途。在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液

22、中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。广泛应用于疾病诊断和治疗、药物筛选等。为快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。也应用在差异表达分析、杂交测序等技术中。23.化学法测序法的基本原理。碱基通过特定化学试剂修饰后，哌啶甲酸使该位置的磷酸二酯键断裂。G反应：硫酸二甲酯使G上的N7甲基化；A G反应：甲酸使A和G嘌呤环上的N质子化；C T反应：肼使T和C的嘧啶环断裂后重新环化成五元环；C反应：盐存在的条件下，肼只与C反应；凝胶电泳将DNA链按长短

23、分开；根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。适用性：测定短DNA片段和某些被修饰的DNA。24.Sanger测序法的基本原理。酶法（Sanger法、双脱氧法、末端终止法）。利用双脱氧核苷酸2，3-ddNTP来终止DNA的聚合反应。样品一链为模板，引物5端标记。在4只试管中分别加入适当的引物、模板、4中dNTP、DNA聚合酶，再分别加入一种ddNTP。与模板结合引物在DNA聚合酶作用下从5端向3端进行延伸反应。当ddNTP参入时，由于它在3位置没有羟基。故不与下一个dNTP结合从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

24、同时分离4只管中的反应物，由于每一反应管中只加入了ddNTP，则该管中各种长度的DNA都终止于该碱基，且电泳中该泳道不同带DNA3端为同一种ddNTP。根据泳道中DNA带位置读出与模板链互补的新链系列。25.酵母双杂交技术的基本原理将BD与已知蛋白E融合产生的BD-E称为诱饵（Bait），将AD与末知蛋白F融合产生的AD-F称为猎物（Prey），当诱饵钓到猎物时（E和F间有相互作用），转录激活因子就能激活目标基因（报告基因）的转录与表达26.核酸杂交中，探针标记的方法有哪些？1）缺口平移法：标记dNTP2）随机引物法：3）末端标记法：碱性磷酸酶和多核苷酸激酶5标记；末端转移酶3标记4）PCR法

25、：基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达1、SD序列：mRNA中的核糖体结合位点，位于翻译起始位点上游，负责翻译的起始2、表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体3、融合表达：动物或者是植物的细胞经过某种培养经过酶的作用使其细胞相融合构成的新细胞 4、inclusion body：包含体，蛋白质在大肠杆菌中大量表达时，在胞内聚集形成不可溶的、没有生物活性的固体颗粒。5、T7启动子：A.强大的 T7 启动子完全专一受控于 T7 RNA 聚合酶， B.T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大肠杆菌RNA 聚合酶的快 5 倍 C.由于大

26、肠杆菌本身不含 T7 RNA 聚合酶 ，需要将外源的 T7 RNA 聚合酶引入宿主菌（采用DE3溶源菌，T7RNA聚合酶置于LacUV5启动子控制下，IPTG间接诱导）。6、AOX1：编码乙醇氧化酶的基因1、表达载体有哪些特点？（1）、具有强的启动子，如T7、SP6、tac、的PL等；（2）、启动子和ATG之间具有核糖体结合位点（SD序列）；（3）、具有强的转录终止序列。2、谈谈pET表达载体系统表达目的蛋白的优点。3、蛋白质分泌表达的优点和影响因素？蛋白质分泌表达的优点：1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标蛋白质的纯化就比较简单2. 蛋白质酶解的程度不甚严重3. 促进了二硫键的形成和蛋

27、白质的折叠作用（氧化环境）4. 蛋白质的N-末端结构真实正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在体内对信号肽进行切割影响分泌表达的因素：（1）信号肽存在与否和类型；（2）启动子强弱；诱导剂浓度；（3）宿主菌的类型；培养条件（温度、培养基）4、原核表达系统和真核表达系统相比，各自的优缺点是什么？ 原核表达系统的优点：（1）产量高、表达高效；（2）操作简单（可调控表达、方便纯化）；（3）可大规模发酵生产；（4）成本低。原核表达系统的缺点：（1）缺乏真核中的修饰系统，产物有时缺乏活性。（2）表达产物易形成包含体真核表达系统的优点：书78页（甲醇酵母表达系统的优点） 易培养、繁殖快、便于基因操作真核表达系统

28、的缺点：（1）缺乏强有力的启动子（2）分泌效率差（3）表达质粒易丢失5、原核表达中产生包含体的原因和解决措施有哪些？ 产生包含体的原因：（1）原核细胞缺乏真核细胞的修饰系统；（2）缺乏折叠所需的酶和辅助因子，无法正确折叠；（3）合成速度过快，产量太高；（4）蛋白质类型；（5）培养条件（温度和培养基）解决措施：（1）降低培养温度；诱导物浓度；（2）培养基中加入添加剂；培养基组分、pH等。6、酵母菌表达外源蛋白的优点。 （1）遗传背景清楚（2）属真核模式生物，具备蛋白质翻译后加工系统（3）可发酵生产（4）不产生内毒素，属安全的表达系统7、甲醇酵母表达系统的基本构成和特点 基本构成： 甲醇酵母表达载体为整合型质粒，整合位点一般位于HIS4（组氨酸脱氢酶