生物参考资料工艺学实验.docx

1、生物参考资料工艺学实验生物工艺学实验实验指导（适用生物工程专业）屈慧鸽 冯志彬 程仕伟编写鲁东大学生命科学学院实验一 呼吸缺陷型酵母菌株的诱变选育一、实验目的1、理解呼吸缺陷性酵母的筛选原理；2、掌握呼吸缺陷性酵母的筛选步骤。二、实验原理部分酵母菌在一定的物理（如紫外线）或化学诱变剂作用下发生基因突变而丧失呼吸能力，呼吸缺陷性酵母菌株即为丧失呼吸能力的突变株，其对非发酵型底物如甘油、酒精、醋酸等不能氧化，但CO2放出高于对照株，酒精脱氢酶活力也较对照高出1倍左右，对提高酒精产率有好处。同时，呼吸缺陷型也是育种工作可利用的一个有效的遗传标记。三、实验材料1.菌株：酒精酵母2.培养基CM培养基：葡

2、萄糖 40g MgSO4 2g蛋白胨 10g 琼脂 18g酵母膏 5g 水 1000mlKH2PO4 5g不加琼脂即为液体CM，分装20ml于250ml三角瓶中。TTC上层培养基葡萄糖 5g TTC（红氮四唑） 0.5 g琼脂 10g 水 1000ml 分装，121灭菌 15min。TTC下层培养基葡萄糖 10g MgSO4 7H2O 0.4g蛋白胨 2 g 琼脂 18 g酵母膏 5 g 水 1000 mlKH2PO4 1 g pH 5.55.7MM甘培养基酵母膏 6.7 g 甘油 20 ml水 980 ml pH 5.5琼脂粉 18 g 分装，121灭菌 10min。3、仪器设备紫外诱变箱、

3、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱四、操作步骤1、培养基配制：配制实验过程中所需全部培养基并准备诱变及筛选所需的移液管、试管、平板等物品，121灭菌20min，其中TTC上层板培养基灭菌后备用，无需倒平板；2、菌种活化：取活化后的酵母菌1环，接入到三角瓶中液体CM培养基，200r/min、30振荡培养过夜；3、菌悬液制备：将培养好的酵母细胞4000r/min离心洗涤3次，调整细胞浓度为106/ml备用，实验过程无菌操作；4、诱变：取15-20ml菌悬液于灭菌空白平板内，磁力搅拌器转速为30r/min，调整与紫外灯管距离为20cm，开盖照射45-75s，盖上盖诱变结束；5、稀释涂布：将诱变后的菌

4、悬液梯度稀释至10-6，于CM平板涂布，避光培养24-36h，选择菌落个数合适的平板备用；6、点接：将CM培养基平板上长出的菌落点种 TTC下层平板上，30培养24-48h；7、鉴定：将TTC上层培养基溶化并冷却（不烫手）后，小心倾入TTC上层培养基上，使其刚好掩埋菌落。等凝固后，30培养23h。此时，平板菌落颜色会区分成红色、粉红色和白色。呼吸缺陷型突变株为白色菌落。8、复检：用无菌牙签将在TTC鉴别培养基上生长的白色小菌落分别点种到MM甘培养基和CM培养基上。注意点种时，先点MM甘培养基，后点种CM培养基，并在平皿上做好标记。30培养24h观察实验结果。五、实验结果分析1、描述实验结果计算

5、呼吸缺陷性酵母突变率，并分析实验过程中影响诱变效果的因素；2、对比并参照其他小组实验结果，评价本小组实验过程中的利害得失六、数据分析突变率：平板计数法七、思考题1、分析呼吸缺陷型突变株为白色菌落为白色，其它菌株红色、粉红色的机理。2、呼吸缺陷性酵母筛选工作有何现实意义？3、如果白色小菌落分别点种到MM甘培养基和CM培养基上培养后都有生长，讨论有哪些原因？实验二 红曲发酵及红曲色素的提取一、实验目的1、了解红曲菌液体菌种的制备方法, 为红曲发酵实验准备液体种子。2、了解固体发酵的工艺过程 , 在实验室中小规模制备红曲。3、熟悉从红曲中分离代谢产物的方法，以及掌握红曲色素色价的测定方法。二、实验原

6、理 红曲霉菌属真菌界(Eumycophyta)、子囊菌门(Ascomycota)、真子囊菌纲(Euascomycetes)、散子囊菌目(Eurotiales)、红曲菌科(Monascaceae)、红曲菌属(Monascus)。由红曲霉接种于大米发酵得到的红曲是我国古代的一大发明，称为丹曲，至今已有1000多年的历史，很早就应用于食品着色、食品发酵以及中医中药。红曲霉作为红曲的生产菌, 以其可产生大量天然色素而著称。红曲的应用主要有三方面：食品色素、药物和发酵食品。红曲色素是红曲霉在生长代谢过程中产生的天然色素，是红曲霉的次生代谢产物，具有热稳定性好，蛋白着色力强，色调柔和，可以提高加工制品对光

7、和氧稳定等优点；而且红曲色素无毒性、无致突变作用，安全性很高，因此红曲可提供安全性高的天然色素。红曲色素分为黄色素、橙色素和紫红色素，其中黄色素包括红曲素(Monascin)和黄红曲素(Ankaflavin)，橙色素包括红斑红曲素(Rubropunctatin)和红曲玉红素(Monascorubin)，紫红色素包括红斑红曲胺(Rubropunctamine)和红曲玉红胺(Monascoru- bramine)。凡色素的呈色都与其结构有着密切的关系，结构的形式与变化内在决定着物质的呈色与变色。大米经红曲菌固体发酵后产生了一系列红曲菌的代谢产物, 但这些产物的量非常少, 大米仍占固体发酵产物的绝大

8、部分体积, 为了降低运输成本, 常常要对红曲菌的代谢产物进行提取和浓缩。红曲的代谢产物中既有水溶性组分, 也有脂溶性组分, 因此可用 80% 的丙酮(丙酮:水 =80：20)抽提。用 HCl 或 NaOH 处理可以将其中的酸溶性组分、碱溶性组分和中性组分分开。选择溶剂一般要注意以下四点： 溶剂对所需成分的溶解度要大，对杂质溶解度要小，或反之。 溶剂不能与天然药物成分产生化学反应，即使反应亦属于可逆性的。 溶剂要经济易得，并具有一定的安全性。 沸点宜适中，便于回收反复使用。红色素能溶于80% 的乙醇中 , 可通过萃取从米粒中提取出来, 红曲色素在505nm 处有最大的吸收峰, 可用分光光度计来测

9、定。三、实验器材与试剂1菌种：红曲50032培养基玉米面液体培养基（g/L）：蛋白胨 20；玉米面 20；酵母浸粉 10；硫酸镁0.5；磷酸氢二钾 1；硫酸亚铁 0.1；pH 6.0。发酵培养基：大米培养基3、仪器与设备恒温摇床, 超净工作台, 高压蒸汽灭菌锅、旋转蒸发仪、恒温培养箱等。四、实验步骤1、红曲液体种子制备：配制制玉米面液体培养基。500mL 三角瓶中装玉米面液体培养基 150mL, 包扎后 0.lMPa 灭菌 20 分钟；玉米面液体培养基灭菌冷却后 , 每瓶中接入 1/4 支红曲斜面菌苔 ( 注意无菌操作 )；接种后置30恒温摇床中 180 rpm 摇瓶培养 3天。2、固体培养基

10、制备及接种1）浸米 :25 以上浸米 58h, 大米吸收水分约在 28%30% 。2）蒸米: 将浸好的米用清水淋去米浆水, 沥干, 即可蒸米。上汽火力要强, 待全部圆气以后，蒸煮35min, 出饭率在 135%, 饭粒呈玉色, 粒粒疏松, 不结团块。蒸米不能熟透。3）摊凉接种: 将蒸熟的曲料倒在超净工作台上迅速打碎团块, 摊平冷却到 3032 然后, 每 1kg 米接种液体种子20ml, 充分翻拌混合均匀,操作要迅速, 以减少杂菌污染。3、红曲固态发酵: 将曲料摊在曲盘内, 厚度约 3-5cm。3233 保温保湿培养。每天翻曲一次，观察到曲粒表面略有干皮、少数曲粒略有微红斑点等现象时即可“吃水

11、”, 使曲粒吸收一定水分, 以利菌丝逐渐向内生长。吃水方法: 一边拌曲，一边向曲盘中喷洒无菌水, 使曲粒表面润湿并微有发胀。培养3天后米粒逐渐成红色。观察记录色素产生的过程。培养5-7天后，固态发酵结束的红曲置于鼓风干燥箱内5060鼓风干燥。4、成品质量检查外观检查 : 曲粒表层光滑紫红, 曲粒中心呈玉色, 不得有空心和红心。曲粒断面菌丝均匀，具有红曲特有的曲香, 不得有酸气等不正常气味。 生物与理化项目检查: 水分12%以下, 容量 (l00mL)44.546.5g, 淀粉含量59-62%, 无细菌和其他霉菌污染。5、红曲色素提取：1）取 200g 固体发酵之红曲, 在植物粉碎机中将其粉碎；

12、2）将红曲粉放于 500mL 三角瓶中, 加入提取液(丙酮 : 水 =80:20)300mL；3）室温下浸提 1 天, 每隔 2 小时摇动一次, 过滤；4）沉淀用同样提取液洗涤 2 次, 每次 100ml, 合并滤液；5）在旋转蒸发仪中减压蒸去丙酮( 尚有水分 )；6）用 l mol/L HCl 调残留液(约 l00mL)的pH至3.0, 加至分液漏斗中；7）用 150mL 醋酸乙酯分次抽提；8）以同样方法按下图分离碱(溶)性组分、中性组分和酸(溶)性组分, 观察各组分的颜色；9）将各分离到的组分在旋转减压蒸发仪中蒸去溶剂, 低温保存。五 实验结果分析1、根据实验结果绘制红曲色价生成曲线，分析

13、影响红曲色素合成的因素2、根据红曲色素分离实验结果描述红曲色素组分及特性六、参数测定红曲色价测定：1）称取红曲米样品 0.5g, 放入带有刻度的 lO mL 具塞试管中；2）加入 80%的乙醇 8 mL, 摇匀,60水浴保温萃取0.5h；3）取出冷却, 用普通定性滤纸过滤入lO mL 量筒中, 用 80% 乙醇洗涤残渣 2 次, 合并滤液, 并用 80% 乙醇定容至10mL；4）以 80% 乙醇作对照, 在 505nm 波长下, 用 lcm 比色皿测定样品的吸光度。5）计算: 红曲色价(以lg样品计)=A505lO2注意：发酵后期, 若红色素产生量多, 可稀释后测定。七、注意事项 :1. 无水

14、 Na2S04 可回收, 反复使用, 不要扔掉。2. 有机溶剂易燃, 注意远离火源, 原则上应在通风柜中进行。八、思考题 :1比较固态发酵与液体发酵的优缺点，并指出固体发酵的应用范围。2萃取后米粒中仍带有红色, 是否会对结果产生影响?附：红曲代谢产物分离工艺流程图实验三 苏云金芽孢杆菌的培养及粉剂制备一、 实验目的1、 学习苏云金芽孢杆菌的种子制备、发酵生产和产品检测的方法；2、 掌握苏云金芽孢杆菌发酵生产的调控原理。二、 实验原理苏云金芽孢杆菌是内生芽孢的革兰氏阳性土壤细菌，是应用最广的一种微生物杀虫剂，它的主要活性成分是一种或数种杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal pr

15、oteins，ICPs)，又称-内毒素，对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目等昆虫，以及动植物线虫、蜱螨等节肢动物都有特异性的毒杀活性，而对非目标生物安全因此，Bt杀虫剂具有专一、高效和对人畜安全等优点目前苏云金杆菌商品制剂已达100多种，是世界上应用最为广泛、用量最大、效果最好的微生物杀虫剂，因而倍受人们关注。杀虫伴孢晶体蛋白本身无毒，在酸性条件下会变性失去作用，对于人和哺乳动物，当它进入机体后，马上在胃酸作用下变性，而在腔肠动物体内，没有酸性环境，不会马上变性，在碱性条件下马上分解，释放毒性蛋白，起到对集体的毒害作用。利用发酵法可实现苏云金芽孢杆菌的大规模培养，最后加工成含有芽孢、伴孢晶体及其他毒素的粉剂。三、 实验材料一） 设备发酵罐、摇床、显微镜、干燥箱、高速离心机二） 菌种苏云金芽孢杆菌三） 培养基(%)斜面培养基酵母粉 0.5，蛋白胨 1，NaCL 0.5，pH7.0种子培养基：葡萄糖 2，酵母浸粉 0.5，蛋白胨 0.5， K2HPO4 0.1，MgSO4 0.05，硫酸铵 0.5，pH7.0发酵培养基:葡萄糖 3，酵