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1、毒理学基础实验指导讲解卫 生 毒 理 学实 验 指 导编写： 陈秉 符古雅2009年3月目 录实验一 毒理学实验设计 1实验二 实验动物的一般操作技术 10实验三 灭多威经口急性毒性试验 20实验四 苯经呼吸道急性毒性试验 24实验五 蓄积毒性试验 27实验六 亚慢性和慢性毒性试验 29实验七 小鼠骨髓细胞微核试验 33实验八 小鼠精子畸形试验 37实验九 骨髓细胞染色体畸变分析 40实验十 鼠伤寒沙门菌回复突变试验 42实验十一 致畸试验及胚胎胎仔检查方法 47实验十二 网织红细胞计数 53附录：动物实验报告的撰写及注意事项 54实验一 毒理学实验设计一、目的和意义毒理学的很多研究工作需要通

2、过动物实验来进行。使用实验动物进行科研的优点是花费人力、物力较少，时间短，易发现单因素与结果的关系，能提供大量有价值的可与人类生命活动现象相类比的资料。在毒理学实验研究中，健康的实验动物是保证工作顺利进行和获得正确可靠的研究结果的重要条件。 毒理学研究外源化学物对于机体(特别是人体)的有害作用及其机制。毒理学研究的主要手段是动物实验。体内试验是以实验动物为模型，最终目的是通过外源化学物对实验动物的毒性反应，向人(原型)外推，以期评估外源化学物对人的危害及危险性。体外实验主要用于筛选和预测急性毒性和机制研究；人体实验和流行病学调查则可进一步深化和证实在动物实验中所得到的资料。实际上，毒理学作为一

3、门实验科学是以动物实验为中心的，毒理学动物实验的设计、实施、结果观察和评价是毒理学研究的基本方法。 通过本次讨论，要求学生基本掌握毒理学实验设计的原则和方法。二、内容（一）毒理学实验的原则和局限性1、毒理学实验的原则在毒理学的试验中，有三个基本的原则。 第一个原则，化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人。 第二个原则，实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在危害的必需的和可靠的方法。第三个原则，成年健康(雄性和雌性未孕) 的实验动物和人可能的暴露途径是基本的选择。2、毒理学实验的局限性用实验动物的毒理学实验资料外推到人群接触的安全性时，会有很大的不确定性。（二）毒理学常规毒性试验的基本目的

4、 毒性评价或安全性评价方面的基本目的包括以下几点： 1. 受试物毒作用的表现和性质。 2. 剂量-反应(效应)研究。 3. 确定毒作用的靶器官。 4. 确定损害的可逆性。 毒理学研究还可能有其他的目的和要求，例如毒作用的敏感检测指标和生物学标志、毒作用机制研究、受试物的毒物动力学和代谢研究、中毒的解救措施等。对这些要求，应扩展常规试验的设计以包括有关的项目，或者另外设计和进行靶器官毒理学研究及机制毒理学研究。（三）实验动物的选择毒理学的动物实验是以实验动物作为研究对象的，为获得可靠的研究结果，先决条件是正确地选用实验动物。1、实验动物物种的选择 对实验动物物种选择的基本原则是：选择对受试物在代

5、谢、生物化学和毒理学特征与人最接近的物种；自然寿命不太长的物种；易于饲养和实验操作的物种；经济并易于获得的物种。在毒理学研究中常用的实验动物物种如下：大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的实验动物有地鼠、猕猴、小型猪、鸡等。常用实验动物生物学和生理学参数见表1-1。以上实验动物各物种中，实际上没有一种完全符合上述物种选择的原则，目前常规选择物种的方式是利用两个物种，一种是啮齿类，另一种是非啮齿类。系统毒性研究最常用的啮齿类是大鼠和小鼠，非啮齿类是狗。豚鼠常用于皮肤刺激试验和致敏试验，兔常用于皮肤刺激试验和眼刺激试验。遗传毒理学试验多用小鼠，致癌试验常用大鼠和小鼠，致畸试验常用大鼠、小鼠和兔。

6、迟发性神经毒性试验常用母鸡。表1-1 常用实验动物生物学和生理学参数参 数猴狗猫兔大 鼠小 鼠豚 鼠地 鼠成体体重(kg)3.514.03.33.70.450.0350.430.12寿命(a)161514631.531水消耗(ml/d)45035032030035614530饲料消耗 (成本g/d)1504001001801051210成体代谢(calkg d)1588080110130600100250体温()38.838.938.639l438l237.438.638.0呼吸频率50202553851609083(次min)(4060)(1030)(2030)(4065)(65110)(8

7、0240)(70100)(35130)心率(次min)200100120200328600300450血压 mmHg15912714810015510011080130/901207577/50108/77(收缩舒张)出生体重(g)500700110022001251005-61.5751002.0断乳时体重(g)44005800300010015004050101225035开眼(d)出生当天81281210101211出生当天15妊娠(d)16863633121206716性周期(d)282215281516454516194动情期(d)12713919301111窝数量136161136

8、911215112断乳年龄(周)16246698343234生殖年龄(月)549106723232生殖期(年)10155104131131生殖季节任何时间春，秋冬季23个月任何时间任何时间任何时间任何时间任何时间所需面积(tf2)*68330.40.40.70.34环境温度()18281828182818281925192519251925血容量( ML/Kg)7579605365807585凝血时间(s)90180120300601460143HCT(红细胞)4245404246414250Hb(gbl)12.516.011.813.614.816.012.412.02、实验动物品系的选择品

9、系(strain)是实验动物学的专用名词，指用计划交配的方法，获得起源于共同祖先的一群动物。实验动物按遗传学控制分类可分为：近交系：指全同胞兄妹或亲子之间连续交配20代以上而培育的纯品系动物。如小鼠有津白I、津白、615，DBA1和DBA2，BALB/C，C3H，C57B6J，A和AHe等。杂交群动物(杂交1代，F1)，指两个不同的近交系之间有目的进行交配，所产生的第一代动物。封闭群：一个种群在五年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所随机交配繁殖的动物群。如昆明种小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、F344大鼠、Wistar大鼠、SD(Sprague-Dauley)大鼠等。 根据实

10、验动物遗传的均一性排序，近交系最高、杂交群次之、封闭群较低。不同品系实验动物对外源化学物毒性反应有差别，所以毒理学研究要选择适宜的品系，对某种外源化学物毒理学系列研究中应固定使用同一品系动物，以求研究结果的稳定性。 遗传毒理学一般利用啮齿类动物，主要是小鼠或大鼠。如果有合适的理由，其他物种也可接受。有的文献报告在小鼠骨髓微核试验MSAe品系比ddy，CD-1或BDF品系更敏感。但一般认为还没能证明某一品系对所有的遗传毒性物质比其他品系都敏感。在致癌试验中对实验动物的品系有一定的要求，特别重视有关病理损害的自发发生率。3、对实验动物微生物控制的选择 按微生物控制分类，实验动物分为四级，见表1-2

11、。对于毒性试验及毒理学研究应尽可能使用二级(或二级以上)的动物，以保证实验结果的可靠性。表1-2 实验动物微生物等级级 别要 求I 级 级 级IV 级普通动物，应没有传染给人的疾病 清洁动物，除I级标准外，种系清楚，没有该动物特有的疾病 无特定病原体动物(SPF)，除级标准外，动物为剖腹产或子宫切除产、按纯系要求繁殖，在隔离器内或层流室内饲养，可有不致病细菌丛，没有致病病原体 无菌动物，在全封闭无菌条件下饲养的纯系动物，动物体外不带有任何微生物和寄生虫(包括绝大部分病毒)4、个体选择 实验动物对外来化学物的毒性反应还存在个体差异，应注意实验动物的个体选择。 （1）. 性别 同一物种、同一品系的

12、实验动物雌雄两性通常对相同外源化学物毒性反应类似但雌雄两性对化学物的毒性敏感性上存在着差别。 如果已知不同性别的动物对受试物敏感性不同，应选择敏感的性别。如对性别差异不清楚，则应选用雌雄两种性别。如实验中发现存在性别差异，则应将不同性别动物的实验结果分别统计分析。 在遗传毒理学体内试验中，对性别的选择有几种意见： 对单个物种应用两种性别。 对单个物种应用两种性别，除非已在一个性别得到阳性反应，就不必对另一种性别进行试验。 对单个物种应用两种性别，除非经毒代动力学研究证明受试物(和其代谢产物)在雄性和雌性无差别和或如果在确定剂量的预试验证明有相等毒性。此假定在非遗传毒性与遗传毒性之间有相关。 对

13、单个物种常规用一种性别(雄性或雌性)，除非预期证明存在性别差异。由于历史的原因UDS体内体外试验常规用雄性大鼠。 一般来说，对于初次试验的受试物，应该采用两种性别。对大鼠和小鼠各一种性别进行试验可能比单个物种两种性别提供更好的危害鉴定，但这需要更多的资料来证明。 （2）. 年龄和体重 （3）. 生理状态 （4）. 健康状况 (四)毒理学试验设计要点1、体内试验设计 1）. 剂量分组 在毒理学试验中，最重要的就是研究剂量-反应(效应)关系，也就是当外源化学物染毒剂量增加，实验动物的毒性反应(效应)随之而增强。剂量-反应(效应)关系的存在是确定外源化学物与有害作用的因果关系的重要依据，也可证明实验结果的可靠性。因此，在毒理学试验中，一般至少要设3个剂量组(即高剂量组、中剂量组、低剂量组)，希望能得到满意的剂量-反应(效应)关系。 特别注意设立对照组：1 未处理对照组(以前有称为空白对照组)：2 阴性(溶剂/赋形剂)对照：3 阳性对照： 历史性对照： 2）. 各组动物数 3）. 试验期限 2、体外试验设计 1）测定受试物溶解性 2）试验最高剂量的推荐 3）. 代谢活化 4）. 阳性对照 5）. 重复 （五）实验动物的染毒和处置1、动物实验前的准备2、受试物和样品的准备3、染毒途径4、实