超全干细胞重点知识总结.docx

1、超全干细胞重点知识总结第九章 干细胞第一节 干细胞概述一、干细胞( stem cells)与个体发育正常生物个体发育的过程是按严格的时空程序进行的一系列细胞分裂、分化和细胞凋亡相互协调作用的结果。从一个受精卵、全能胚胎干细胞或组织谱系干细胞最终分化为具有独特功能体细胞所组成的组织器官,这是一个彼此协调而又制约的复杂过程,这一过程通常被称为发育的遗传程序(genetic program) ,被记录在细胞基因组的结构中。不同物种有不同的遗传程序,这可能是物种在长期进化过 程中逐渐形成的。在哺乳动物个体发育的不同阶段,包括胚胎、幼年和成年个体的各个发育时期,都存在着发育潜能参差不同的干细胞。干细胞最

2、终演变为独特结构和功能的体细胞或成熟生殖细胞,这过程即是所谓细胞分化。从分子水平而言,可以认为细胞分化是部分基因选择性地被激活或差异性表达,从而控制专一性蛋白质的合成和排布的结果。对正常细胞分化来说,最重要的是多个基因表达过程在数量和时空上的精确联系和密切配合,并受不同层次的基因调控网络系统精确无误地调节和控制。干细胞在胚胎和成体组织内部的活动,包括干细胞基本特性的分子机制和调节控制、胚胎细胞的迁移活动、时空程序与相邻胚胎细胞的相互作用,对细胞增殖和分化的关系等,虽已有所了解,但由于技术上的原因,直接证据还很少,因此,干细胞增殖和分化问题仍是今天发育生物学研究的主题内容之一.二、干细胞的定义和

3、分类因干细胞是指一类具有自我更新和产生分化后代这两种基本特性的细胞。 一个充满生命力的雌雄两性机体都是由两类不同的组织和器官构成的。一类是全部由体细胞组成的,另一类是以生殖细胞为主的,也包括一些由体细胞组成的组织和器官构成的。前者是执行机体生命活动各种生理功能的;后者一切都为了保证生殖系统的卵巢和辜丸中的卵子和精子的发育和成熟并延续生命的。对人类来讲,从一个受精卵的单细胞要产生200多种不同类别的细胞来构成各种组织和器官,必然要靠全能性的早期胚胎干细胞通过自我更新和产生分化后代来实现的。自我更新是指干细胞可进行均等分裂,产生两个遗传特性上完全一样的干细胞,均等分裂是大多数细胞的特性,而产生分化

4、后代指的是干细胞还可进行不均等分裂,产生的两个子代细胞中一个仍是干细胞,而另一个是遗传特性有所不同的,要开始走上分化道路的定向祖细胞。早期胚胎细胞是全能的,它既可产生体细胞,又能产生生殖细胞,这包括从早期的卵裂球和囊胚期的ICM细胞以及后来胚胎的3个胚层已分化后的生殖嵴区的原始生殖细胞;而分化的后代细胞可从包括全能细胞向多能细胞和细胞谱系的各级祖细胞发展,这些细胞仍旧可通过均等和不均等两种分裂方式进行繁殖,一直到最后的终未分化体细胞。干细胞可分为两类:一类干细胞包括从早期囊胚ICM (inner cell mass)细胞分离并在体外培养和建系的胚胎干细胞(embryonic stem cell

5、s,简称ES细胞)和从胚胎生殖嵴原始生殖细胞(primordial germ cells, PGC)分离建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,简称EG细胞) ;另一类是先在成年组织和器官,以后在胎儿组织被证明其存在,随后个别也在体外培养和建系成功的干细胞, 称为组织干细胞( tissue stem cells) ,又称成体干细胞(adult stem cells) 。三、胚胎干细胞研究简史哺乳动物早期胚胎体积小,又在母体子宫内发育,因此,要在体内对各类干细胞的分化及其机制进行 实验研究几乎不可能。从20世纪50年代开始,人们一直在致力于寻找一个既能在体外增殖,又具有胚胎

6、细胞全能性(totipotency)或多能性的(pluripotency)并通过适当条件能被诱导分化为各种类型分化细胞的实验模型。20世纪50年代末美国发育生物学家Stevens (1967)将着床前发育阶段的小鼠胚胎(包括受精卵) 或12天胚龄的胚胎生殖嵴异位移植到同系成年小鼠辜丸或肾脏被膜下,移植后7天,发现有80%接种灶出现并发展为畸胎瘤。从中分离、培养和建立了胚胎性癌细胞(embryonal carcinoma cell, EC)系,揭开了胚胎性干细胞早期研究的序幕。EC细胞既具有恶性生长又具有早期胚胎细胞发育多潜能性的双重性质。在20 世纪70年代, EC细胞常用作研究哺乳动物发育遗

7、传以及细胞分化的实验模型,并取得了一些重要结果。后因EC细胞核型异常,分化细胞类型有限等缺点而不再被使用。20世纪80年代初,英国Evans和Kaufman以及美国Martin 2家实验室独立地从小鼠囊胚成功地建立了能在体外不断增殖,并维持不分化状态的多潜能胚胎干(ES)细胞系,开创了ES细胞生物学研究的新时代。但此后ES细胞在其他动物上的分离和建系却颇受挫折,直到20世纪80年代后期才有所突破,见表 19.1。 20世纪90年代初,美国Matsui等从小鼠9天胚胎生殖嵴建立了多潜能的胚胎生殖细胞系,同一时期,少数其他动物也相继建立了ES或EG细胞系。1998年美国威斯康星大学Thomson等

8、人利用36枚新鲜或冻存的人工体外受精胚胎,获得人ICM细胞,经体外培养后,首次成功地建立了5株人类ES细胞系,同年, John Hopkins医学院Shamblott等人从5 -9周人流胚胎的生殖嵴和肠系膜首次培养出人EG细胞系。第二节 胚胎干细胞胚胎干细胞又称ES细胞主要是指从早期胚胎的卵裂球、囊胚ICM细胞分离培养和建系的细胞。而从胚胎生殖嵴中PGC分离培养建成的称胚胎生殖细胞简称EG细胞。这2类干细胞统称为胚胎性干细胞,其最基本的重要特性是具有稳定地在体外自我更新并保持不分化和发育的多能性,即可以在体外分化为属于3个胚层的各种细胞。一、ES和EG细胞培养、建系技术体外培养建系ES和EG细

9、胞的技术以小鼠的最为成熟,成功率最高,其基本原则是有赖于获得全能性胚胎细胞或细胞团并建立体外适合其增殖和抑制分化的培养系统。由于早期胚胎细胞离体后极易发生分化,首先要解决阻止其分化、确保维持其全能性或多能性这一关键问题。目前常用的细胞分化抑制物主要有3种:饲养层细胞( feeder layer cells)、特殊细胞的条件培液(conditioned medium) ,如BRL (Buffalo rat liver)细胞条件培液,分化抑制因子(differentiation inhibitory factor, DIF) ,如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor

10、, LIF) 。此外,也有添加通过gp130信号转导途径的细胞因子,例如,白介素6 (lL一6)、Oncostatin M和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)等同样可达到维持小鼠ES细胞的不分化状态。 因此,体外培养ES和EG细胞可划分为两大类:饲养层培养法和无饲养层培养法。(一)饲养层细胞培养法不论ES细胞或EG细胞,原代或初期培养阶段一般都需依赖于能分泌使它们在体外存活和增殖所必需生长因子的饲养层细胞。不同类型的饲养层细胞分泌的生长因子略有不同。但都要求在ES或EG细胞培养过程中的饲养层细胞保持不分裂增殖,而仍然保持细胞的代谢活性。常用的

11、饲养层细胞有下列两种:一种是取自各种品系小鼠交配后12 dpc (days post coitum)的胚胎成纤维细胞(embryonic fibroblast, MEF) 。经丝裂霉素C (mitomycin C)处理以终止细胞分裂后,用作ES细胞培养的饲养层。另一种是来自SIM小鼠 (S)胚胎的对硫代鸟嘌岭(thioguanine, T)和乌本苷(ouabain, O )有抗性的成纤维STO细胞系,主要分泌干细胞生长因子(stem cell factor, SCF)和白血病抑制因子(LIF)。此外,SL - M220细胞是小鼠胚胎造血的基质细胞SI/SI4经基因改造产生专一性跨膜型SCF的细

12、胞系,以它作为饲养层更有利于促进EG细胞生长。用作 ES细胞或EG细胞培养的饲养层的MEF或STO细胞均需用10 mg/L丝裂霉素C在370C灭活,用前经PBS 彻底洗涤。(二)无饲养层培养法饲养层细胞的制备在一定程度上使ES和EG细胞培养过程显得较为繁杂。近来以添加某些特定细胞的条件培养液和LIF生长因子至含胎牛血清(FCS)的正常培养液,借此替代饲养层细胞。有3种条件培养液可用于小鼠ES细胞培养:直接在ES细胞基础培养液中加入重组生长因子和LIF等。Buffalo大鼠肝细胞条件培养液(BRL-CM)。2 -3周龄幼年大鼠心肌细胞条件培养液(RH - CM) 。一般以2 -3份上述细胞条件培

13、养液加1 - 2份新鲜的ES细胞培养液,再添加10% - 20%胎牛血清,共同组合成无饲养层的ES 细胞培养系统。但往往在胚胎干细胞原代和建系初期缺乏饲养层时,用这种条件培养液培养ES和EG细胞成功率不高,因此,正确使用饲养层细胞和条件培养液在ES/EG细胞建系初期仍是成功的一个关键因素。(三) ES和EC细胞的体外培养1. ES细胞不同动物,甚至同种不同品系动物的胚胎发育速度和方式存在着较大差异,例如,猪ICM细胞生长与 小鼠的不一样,其生长速率很慢,且有一个休眠(quiescent)时期。因此,ES细胞培养建系需根据各个物种而选择不同发育阶段的早期胚胎。例如,一般小鼠多选用3 -4 d的囊

14、胚或2 - 3 d的桑椹胚,猪取8 - 10 d 的囊胚,绵羊取8 -9 d的囊胚,人和牛取7 -8 d的囊胚。同时,经体外受精的胚胎或由核移植获得的重构胚胎在体外培养至所需适当的发育阶段也是选取ES细胞培养的有效材料来源。基本培养液为含15% - 20% FCS、0.1 mmol/L-疏基乙醇和50IV/mL青霉素、50g/mL链霉素的 DMEM液.将桑椹胚或囊胚接种于预先铺有作为饲养层而无有丝分裂活性的单层MEF细胞的35 mm培养皿中。培养2 -3天后按下列两种方法之一分离出ICM细胞进一步培养:方法一：免疫手术法(immunosurgery)。由于4 - 4.5 dpc的小鼠囊胚主要由

15、己分化的滋养外胚层(trophectoderm)和未分化的ICM细胞组成,前者细胞表面一般已表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC) ,能识别其相应抗体和形成免疫复合物,在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解。 囊胚去除透明带,直接暴露于稀释的兔抗JCR小鼠脾细胞抗血清(抗H - 2b)。再移到新鲜豚鼠血清中, 囊胚的滋养外胚层细胞呈泡状,发生免疫溶解;而ICM细胞不具H -2b抗原,不发生免疫溶解,故细胞完整元损。ICM细胞经Hanks液洗涤后,移至96孔铺有MEF或STO饲养层细胞和DMEM基本培液的板内进一步培养。方法二:常规培养

16、。桑椹胚或囊胚在铺有MEF饲养层的DMEM基本培养液中,未去透明带的桑椹胚或囊胚培养3 -4 d,ICM细胞团从贴壁的囊胚内长出来。吸出ICM细胞团,用0.25% (m/V)膜蛋白酶(trypsin)和0.2 mmol/L EDTA混合消化液在370C消化5 min.部分解离的细胞团移至铺有MEF饲养层的24孔培养板, ICM细胞首先出现贴壁生长,继续培养4 d,可在一些孔内见到巢状集落生长的ES细胞团。用胰蛋白酶消化巢状ES细胞团,并继续培养,一般4 -5 d间隔用胰蛋白酶消化,克隆和纯化ES细胞,视ES细胞密度逐渐转移到较大容积的培养皿或培养瓶。ES细胞在培养过程中,有时在巢状干细胞团周边出现少量分化细胞,这时除了需继续维持饲养层细 胞外,在培液中再添加适量的LIF生长因子,可克服细胞进一步分化的现象。但有的物种例如猪ICM细胞对LIF并不敏感,难以抑制其在体外分化,巢状集落形成率很低, LIF不适用。ES细胞常用培养基的添加物除胎牛和小牛血清外,