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1、 Mainpoint 第一节显微技术（细胞的形态学观察技术）一、光学显微镜二、电子显微镜三、显微操作技术第二节细胞分离技术 第三节生物化学与分子生物学技术第四节细胞培养与细胞杂交本章重点： 1.掌握细胞形态结构的观察方法（主要是光学显微镜、电子显微镜）；2.掌握细胞培养、细胞工程的基本技术；3.了解细胞组分的分析方法。第一节显微技术 工具是人类器官的延伸。显微镜300多年的改进是从器具和观察对象两方面着手提高放大倍数和增加分辨细微结构的能力。 在器具上，包括选择投射于物体上的波束的性质及为便于观察而不断改善操纵装置；在观察对象上，则是如何突显待观察的部分。波束有光波和电磁波， 光学显微镜：以可

2、见光（或紫外线）为光源。电子显微镜：以电子束为光源。 、光学显微镜（TheLightMicroscopy）（一）普通光学显微镜骆驼刺根尖染色体 对二氯苯饱和溶液处理9 光学显微镜是如何作到这一点的（一）普通光学显微镜可变光阑管镜目镜 2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。放大率（magnification）:最终成像的大小与原物体大小的比值;分辨率/力（Resolution）：分辨或区分两质点间最小距离。（一）普通光学显微镜 3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。D=0.61/Nsin 其中为入射光线波长；N=介质折射率； Nsin镜口率（低倍镜0.28，高倍镜0.65，油镜1.

3、25. 2=镜口角（样品对物镜镜口的张角）; 通常2最大值可达140度，空气N1，D约0.3um。 油镜N1.5，此时分辨率D可达0.2um，思考：如何提高显微镜的分辨能力？12 表一、几种介质的折射率（二）相差显微镜 Figure3-2.Interferencebetweenlightwaves.Whentwolightwavescombineinphase,theamplitudeoftheresultantwaveislargerandthebrightnessisincreased.Twolightwavesthatareoutofphasepartiallycanceleachoth

4、erandproduceawavewhoseamplitude,andthereforebrightness,isdecreased.A+/B+ 相位板（annularphaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。分为两种： 1.A+相板：将直射光推迟1/4，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。 2.B+相板：将衍射光推迟1/4，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。（二）相差显微镜基本原理： 利用光的衍射和干涉现象，把光程差变成振幅差（即明暗）。从而提高各种结

5、构间的对比度，明者更明，暗者更暗，立体感增强，使各种结构变得清晰可见。故样品不需染色，适合观察活细胞。（二）相差显微镜 与普通光学显微镜相比有两个特殊之处：相位板 环形光阑（位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 使用时，环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来。 用途：可观察未经染色的玻片标本，活细胞动态，有时也可用于观察缺少反差的染色样品。（三）微分干涉差显微镜（DIC） 原理：利用两组平面偏振光的干涉。光线经棱镜折射后分成两束

6、，分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等，光束分别在距离很近的两点上通过被检物体，在相位上略有差别。由于两光束的裂距极小，而不出现重影现象，使图象呈现出立体的三维感觉。20 平面偏振光光是一种电磁波,光振动的方向与它前进的方向垂直。基础知识 样品经过微分干涉差显微镜,厚度上的微小差异就转化成明暗区别，增加反差，加强影像的明暗效果。 标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。微分干涉差显微镜用于研究活细胞中较大的细胞器，与录像设备结合，可观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。DIC显微镜下的硅藻（伪彩色） （A）普通明视场显微镜下的纤维原细胞（B）相差显微镜下的纤维原细胞,（C）微分干

7、涉显微镜下的纤维原细胞（D）普通暗视场显微镜下的纤维原细胞.23 微分干涉差显微镜原生动物阿米巴变形虫的显微照片。进行人工上色的三维图像展示了丰富的细节。细胞中有些物质，如叶绿体等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料（酸性品红、啶橙，中性红、甲基绿）或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜不仅对这类物质可进行定性、定量和定位研究，还可观察其形状及在细胞内的变化。 （四）荧光显微镜Fluorescencemicroscope Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingr

8、een微管呈绿色、微丝红色、核蓝色 还可进行免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。图像清晰，色彩逼真。 （四）荧光显微镜Fluorescencemicroscope特点： 1.光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；2.有两个特殊的滤光片；3.照明方式通常为落射式。27 荧光显微镜是在光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位的最有力的工具。免疫荧光技术 荧光素直接标记技术 GFP基因与某种蛋白基因融合，可直接观察该蛋白的动态变化。28 第一套滤光片为激发光滤片，装在光源和样品之间，只有能激发荧光染料发光的特定波长才能通过。 第二套为阻断滤片，装在物镜和目镜之间，只让染料所发出的荧光通过。这样

9、，在黑暗背景衬托下，很容易观测到发出荧光的样品。beam-splittingmirror（半透射反射镜）：倾斜的、透明的镜子，使光垂直地反射到观察者的眼中。 Figure3-8.Fluorescentdyes.Thestructuresoffluoresceinandtetramethylrhodamine,twodyesthatarecommonlyusedforfluorescencemicroscopy.Fluoresceinemitsgreenlight,whereastherhodaminedyeemitsredlight.荧光素罗丹明 （五）激光共聚焦扫描显微境 Laserconf

10、ocalscanningmicroscope,LCSM一束光线通过聚焦成点，在样品表面扫描后成象。因为在一个时间试样上只有一个点被照亮。随着试样被扫描，像素的积累便构成了图像。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些分层图像再由计算机重构成三维图像。LCSM的原理：物镜成像透镜 共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。它在某一瞬间只用一束通过检测器前的小孔的光成像，可显著提高分辨率。可以观察较厚样品的内部结构。 样品制备无特殊要求；各种染色、非染色、荧光标记的组织（包括活组织）、培养细胞、粘附细胞、细胞涂片、石蜡切片、冰冻切片。激光

11、共聚焦扫描显微境特点与用途：特点： 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途： 亚细胞定位及动态变化。 能扫描不同层次，重构出样品的三维结构（立体图像）。可改变观察的焦平面，因而能进行“光学切片”，观察较厚样品的内部结构。爪蟾黑色素细胞LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管 共聚焦显微镜由于可以自动改变观察的焦平面，因此纵向分辨率得到改善。分辨率越高，意味着可使用的点数越多，图像越细致。 受精5天后的卵子，一些精细胞仍粘贴在它表面。胚胎和精细胞核呈紫色，而精子的尾巴是绿色。蓝色区域是缝隙连接，它们把细胞彼此联系在一起。果蝇原肠胚表层细胞质内免疫荧光标记的微丝A

12、.免疫荧光技术B.LCSM36 GFP标记的鼠神经中枢干细胞移入刚出生的小老鼠的脑内，已经开始形成少突细胞和星细胞。” Figure3-3.Edgeeffects.Theinterferenceeffectsobservedathighmagnificationwhenlightpassestheedgesofasolidobjectplacedbetweenthelightsourceandtheobserver.（六）暗视野显微镜darkfieldmicroscope38 光学上的丁达尔现象（六）暗视野显微镜darkfieldmicroscope聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进入物镜，

13、只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 应用：观察未经染色4200nm的活体或胶体粒子。（核、线粒体），分辨率比普通显微镜高50倍。 （a）梅毒螺旋体，暗视野。 （b）团藻属和水棉属的绿藻；暗视野。 （c）迂回螺菌具有束状鞭毛的一种个体很大的细菌。相差。（d）肉毒梭菌，它具有近端生卵形内生孢子； （e）草履虫染色后观察到的中央大核和在其边上的球形小核；abcde （七）倒置显微镜inversemicroscope 物镜与照明系统颠倒，物镜在载物台之下，照明系统在载物台之上，用于观察培养的活细胞荧光共振能量转移技术用于研究生物大分子之间的距离和相互作用。

14、传统的蛋白质-蛋白质间相互作用的研究方法都要破碎细胞或对细胞造成损伤，无法做到在活细胞生理条件下实时的对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进行动态研究。荧光共振能量转移技术技术的应用结合基因工程等技术正好弥补了这一缺陷，该技术可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。 （八）荧光共振能量转移技术（fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET）43 （八）荧光共振能量转移技术（fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET） 以GFP的两个突变体CFP、YFP为例简要说明其原理： CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有

15、相当的重叠，当它们足够接近时（10nm范围内），用CFP的吸光激发，其发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏。 荧光共振能量转移技术就是采用非放射方法，在供体和受体相互靠得很近（bYFPaaexemexem 蛋白质a与b之间的相互作用46 例如要研究两种蛋白质a和b间的相互作用，可以根据FRET原理构建融合蛋白，这种融合蛋白由三部分组成：CFP、蛋白质b、YFP。用CFP吸收波长433nm作为激发波长，实验灵巧设计，使当蛋白质a

16、与b没有发生相互作用时，CFP与YFP相距很远不能发生荧光共振能量转移，因而检测到的是CFP的发射波长为476nm的荧光；但当蛋白质a与b发生相互作用时，由于蛋白质b受蛋白质a作用而发生构象变化，使CFP与YFP充分靠近发生荧光共振能量转移，此时检测到的就是YFP的发射波长为527nm的荧光。将编码这种融合蛋白的基因通过转基因技术使其在细胞内表达，这样就可以在活细胞生理条件下研究蛋白质蛋白质间的相互作用。 （九）荧光漂白恢复技术（FRAP）用途：主要检测活体细胞表面或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小。将大分子物质（如蛋白质或脂质）耦联上亲脂性或者亲水性的荧光分子（如荧光素

17、或绿色荧光蛋白），采用高能量激光束照射特定的区域，是该区域荧光发生不可逆淬灭，但由于分子运动，其它区域携带荧光的生物大分子会移向淬灭区，从而恢复荧光漂白。恢复的时间与运动速度有关。当代显微镜的发展趋势 采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。自动化与电子化。光镜标本的制备以石蜡切片为例： 材料处理固定脱水包埋切片染色观察 染色剂：普通染色剂，荧光染色剂二、电子显微镜 （一）透射电子显微镜（二）扫描电子显微镜1.原理 电子束的波长短，并且波长与加速电压（通常50120KV）的平方根成反比。52 扫描电镜：20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。分辨力为510nm

18、。 有效放大倍率为0.2mm/10nm=20xx0X 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。表1、不同光线的波长2.Resolution 肉眼：0.2mm；光学显微镜：0.2um；电子显微镜，0.2nm分辨力与分辨率并不等同。 2.电镜的结构：电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统。3.用途：用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2m、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构。电子显微镜透射电子显

19、微镜 TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。Scanningelectronmicroscope（SEM）表2、电子显微镜与光学显微镜的比较 光学显微镜电子显微镜发光源灯泡电子枪光源可见光、紫外电子束光透镜玻璃透镜电磁透镜真空系统空气真空成象色彩彩色单色样品要求无需脱水需脱水成像原理利用样品对光利用样品对的吸收形成明电子的散射暗反差和颜色和透射形成变化 明暗反差2、电子显微镜用到的一些技术（1）超薄切片技术 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚

20、度仅40-50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。 这就要求样品具有一定的刚性和韧性，SpecimenPreparationforElectronMicroscopy 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水。以热膨胀或螺旋推进的方式切片，厚度:40-50nm石蜡切片的厚度:3-10um;SectionsofLM:5um;SectionsofTEM:复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。主要用来观察胞质中的细胞骨架纤维及其结合蛋白。培养细胞内面的深度蚀刻电镜照片，网格蛋白衣被 Figure3-22.Three-dimens

21、ionalreconstructionfromserialsections.Singlethinsectionssometimesgivemisleadingimpressions.Inthisexamplemostsectionsthroughacellcontainingabranchedmitochondrionwillappeartocontaintwoorthreeseparatemitochondria.Sections4and7,moreover,mightbeinterpretedasshowingamito-chondrionintheprocessofdividing.Th

22、etruethree-dimensionalshape,however,canbereconstructedfromserialsections.（4）电镜三维重构技术研究生物大分子三维结构： 通过电镜技术，从不同侧面，不同层次获得生物大分子的照片，经傅里叶转化，展示生物大分子的三维结构。 生物大分子三维结构是当今生命科学研究的核心课题之一。（5）低温电镜技术： 近几年发展起来的，样品不固定、不染色、不干燥，直接包埋在100nm的冰膜包埋，电镜内-160，用相位衬度成像。展示生物大分子及其复合物表面与内部的空间结构，具更高分辨率。艾滋病毒 （6）扫描电子显微镜SEM 电子“探针”扫描，激发样品

23、表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题。血管破裂，一个个红血球细胞正在慢慢的从破裂的血管流出酵母第三章 METHODSANDTECHNIQUES第二版和第三版P49肺气泡肺癌细胞74 肺气泡是血液交换气体的地方。（三）扫描隧道显微镜 scanningtunnelingmicroscope，STM原理：量子力

24、学的隧道效应，当针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一低电压（2mV2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。分辨率很高:横向为0.10.2nm，纵向可达0.001nm。优点:三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。 STMimage,BenzenemoleculesaccumulateatstepedgesonCu扫描隧道显微镜不仅仅只用于观察单个的原子，还可通过显微镜的尖端、一些精良的刻度尺和稳定的手来操纵单个的原子，如挑选原子或将它们从一边推到另一边。“扫描隧道显微镜

25、是一次一个人操纵原子的首个最好的工具。”通过此办法，成功将12个溴原子通过分子的自我组合排成一个圆圈。三、显微操作技术 micromanipulationtechnique 在倒置显微镜下利用显微操作仪进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作仪是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。 细胞核移植技术已有几十年的历史，Gordon等人（1962）对非洲爪蟾进行核移植获得成功。我国著名学者童第周等上个世纪70年代在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作，并取得了丰硕成果。 Thetechniqueforthetake

26、apartandgatherupofcell,andmicroscopemanipulation PreparationandreformofkaryoplastandcytoplastTransgenicanimalsandplantsTransgenicmice10weeks44gand29g 克隆技术不仅对胚胎学、发育遗传学、医学有重大意义，而且也有巨大的经济潜力。首先克隆技术可用于器官移植，造福人类；也可改良物种，给畜牧业带来好处。另外，克隆技术与转基因技术相结合，可大批量“复制”含有可产生药物原料的转基因动物，从而使克隆技术更好地为人类服务。我国有关科学家提出应明确禁止克隆技术应用于

27、人类，否则将产生一系列伦理学、法律学等的灾难性问题。电子显微镜能否代替光学显微镜？电子显微镜用电子束代替了光束，大大提高了分辨率，电子显微镜相对光学显微镜是个飞跃。但是 电子显微镜：1.样品制备更加复杂；2.镜筒需要真空，成本更高；3.只能观察“死”的样品，不能观察活细胞。1.技术性能要求不高，使用容易；2.可以观察活细胞，观察视野范围广，可在组织内观察细胞间的联系；3.而且一些新发展起来的光学显微镜能够观察特殊的细胞或细胞结构组分。因此，电子显微镜不能完全代替光学显微镜。第二节细胞分离技术 Figure3-31.Afluorescence-activatedcellsorter.当细胞经过激

28、光束时，根据细胞是否带有荧光，包含有单个细胞的液滴被带上正或负电荷。接下来这个液滴在电场作用下被收集到试管中。 注意：细胞的浓度必须调整到绝大多数液滴都不包含多个细胞，多个细胞的液滴不带电荷而流入废液杯中。流式细胞仪一、细胞的分离 二、细胞组分分离技术 1.Thetechniqueofdifferentialcentrifugation Step-by-stepprocedureforthepurificationoforganellesbydifferentialcentrifugation.S=（dx/dt）/2x=110-13sec.密度 Figure3-34.Thepreparativeultracentrifuge. 转速为12.5万rpm的离心机称为高速离心机。 转速2.5万rpm，离心力8.9万，称为超速离心机。 目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500000g。（一）差速离心Differentialcentrifugation特点： 介质密度均一； 速度由低向高，逐级离心。分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核叶绿体线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。 可将细