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1、卍 细胞学 19章 简答论述第一章 绪论1.细胞生物学的概念 2.细胞的发现 3.细胞学说的内容1.细胞生物学的概念细胞生物学是研究细胞基本生命活动规律的科学，它是在不同层次（显微、亚显微与分子水平）上以主要研究细胞结构与功能、细胞增殖与分化、细胞衰老与凋亡、细胞信号传递、细胞基因表达与调控、细胞起源与进化等。核心问题是将遗传与发育在细胞水平上结合起来。2.细胞的发现英国物理学家和数学家Robert.Hooke（胡克）创造了第一架有科研价值的显微镜，放大倍数40140倍，并从木栓中发现蜂巢状小室cell，Hooke于1665年发表显微图谱一书。他在这本书中描绘的“微小孔洞”被认为是细胞学史上第

2、一个细胞模式图。第一次观察到活细胞的是：荷兰布商列文虎克（A.V.Leeuwenhoek）。 300倍 ,1674年3.细胞学说的内容 简述细胞学说的主要内容Cell theory: 现代完整的细胞学说的内容包括 （1）一切生物都由细胞组成； （2）细胞是生物体的最小活动单位； （3）细胞只能通过细胞分裂而来。 意义：显示了细胞对于生命非常重要,把生命的奥秘和生命本身浓缩到了细胞这个微观世界，推动了对细胞的研究。 细胞学说 cell theory 生物科学的重要学说之一，包括三个基本内容：所有生命体均由单个或多个细胞组成；细胞是生命的结构基础和功能单位；细胞只能由原有细胞分裂产生。第二章 细胞

3、的统一性与多样性真核细胞的基本结构体系1.真核细胞的基本结构体系一、基本结构1. 质膜 内膜系统 2. 细胞核(nucleus) :核被膜 染色质 染色体 核仁3. 细胞质 细胞器 细胞质基质微管、微丝 、中间纤维 二、基本结构体系：（亚显微结构水平）(1).生物膜系统脂质与蛋白质 细胞膜、细胞器、核膜(2).遗传信息表达结构系统核酸与蛋白质 染色质、染色体、核仁、核糖体(3).细胞骨架系统蛋白质与蛋白质 细胞质骨架、核骨架第三章 细胞生物学研究方法1.各种显微镜的特点、用途2.细胞及其组分的分析方法 1. 各种显微镜的特点、用途光学显微镜（light microscope ）以可见光为光源

4、电子显微镜（electron microscope）以电子束为光源 比较放大率与分辨率的含义。答案要点：二者都是衡量显微镜性能的指标。通常放大率是指显微镜所成像的大小与样本实际大小的比率；而分辨率是指能分辨或区分出的被检物体细微结构的最小间隔，即两个点间的最小距离。放大率对分辨率有影响，但分辨率不仅仅取决于放大率。（一）普通光学显微镜1. 结构: 照明系统 :光源和聚光器 光学放大系统 :物镜和目镜 机械装置 :用于固定材料和观察方便 2.原理:经物镜形成倒立实像,再经目镜进一步放大成像。3.几个概念: 放大(率)倍数:显微镜最后形成的物体放大像与被检物体的大小比例, 即像高比物高。普通显微镜

5、最大放大倍数10001500倍因为它的分辨率有限，再放大也是空放大 分辨率（resolution）：能将物体相近两点分辨清楚的距离极限(显微镜最重要的性能参数)D= 0.61 / N.A.；代表光波波长；N.A.为镜口率，也称数值孔径。N. A. =n Sin （ /2） n：物镜与标本间介质的折射率；（1或1.515） ：镜口角（聚光焦点对物镜镜 口的张角，180）结论：通过公式可知光学显微镜最大分辨率0.2um 减小分辨率需减小 空气 1 水 1.33 香柏油 1.515 溴 1.66显微镜的几个光学特点：sin /2的最大值小于1；普通光线的波长为400700nm，光镜分辨力约为0.2m

6、，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。（二）紫外线显微镜（ultraviolet microscope）根据光学原理，光源光波越短，显微镜的分辨本领越大。紫外线显微镜以紫外线为光源，分辨率可提高一倍。可看到在普通光学显微镜下看不到的胶体颗粒。可用来测定细胞中的核酸含量。透镜：石英、萤石（CaF2)、碳酸锂等制作。价格昂贵，使用受限。（三）荧光显微镜（fluorescent microscope）20世纪40年代在紫外线显微镜基础上发明。敏感性高，主要用于细胞结构和化学成分等的研究。原理：细胞中有些物质，如叶绿素等，受激发光照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光

7、，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经过照射也可发荧光。荧光显微镜对这类物质进行定性或定量研究。不同荧光素需要特定波长的激发光，并产生不同颜色的荧光结构：在普通光学显微镜上添加一些附件：A.光源：通常采用超高压汞灯或氙灯，由它发出各种波长的光。B.滤片：根据性能分为两组。 一是激发滤片，作用是仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其它光都吸收掉。 二是阻断滤片，安装在物镜后，作用是吸收和阻挡激发光进入目镜，以免干扰荧光和刺伤眼睛；选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。荧光显微镜是以紫外线为光源，照射被检物体发出荧光，在显微镜下观察形状及所在位置，图像清晰，色彩逼真。荧光显微镜可以观

8、察细胞内天然物质经紫外线照射后发荧光的物质（如叶绿体中的叶绿素能发出血红色荧光）；也可观察诱发荧光物质（如用丫啶橙染色后，细胞中RNA发红色荧光，DNA发绿色荧光），根据发光部位，可以定位研究某些物质在细胞内的变化情况。（四）暗视野显微镜（dark field microscope）原理：显微镜加装挡光片，使直射光不能进入物镜，只允许被标本反射、衍射的光线进入物镜特点：视野的背景是暗的，样品的边缘是亮的。 特殊装置：在聚光器中加装中央遮光板或者使用暗视野光阑（五）相差显微镜（phase contrast microscope）这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。主要用于观察活

9、细胞或活组织，是体外细胞和组织培养工作的重要工具。原理：将透过标本的可见光的光程差（也就是相位差）变成明暗差（即振幅差），从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。构造：聚光器或光源上安装环状光阑；在物镜中加了环形相板)。相差显微镜通过安装特殊装置（如相差板等）将光波通过样品的光程差或相差位转换为振幅差，由于相差板上部分区域有吸光物质，使两组光线之间增添了新的光程差，从而对样品不同同造成的相位差起“夸大作用”，样品表现出肉眼可见的明暗区别。相差显微镜的样品不需染色，可以观察活细胞，甚至研究细胞核、线粒体等到细胞器的形态。（六）微分干涉相差显微镜（differential inter

10、ference contrast (DIC) microscope ）1952年，Normaski在相差显微镜原理的基础上发明。能显示结构的三维立体投影影像。（七）激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope） 用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，图像以电信号形式记录。 由于激光束的波长较短，光束很细，有效排除焦点以外的光信号干扰，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。 激光共聚焦扫描显微镜随时采集记录信号，既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。 普通光学显

11、微镜：0.2um 紫外线显微镜： 0.1um二、电子显微镜（electron microscope）简称电镜电子显微镜以电子束代替了可见光，大大提高了显微镜的分辨率，可以观察细胞的亚显微结构。电子束的波长与电压成反比，波长极短。德国西门子公司制成了第一台电子显微镜，当时分辨率只有3nm。1964年后达到0.3nm，现在最佳性能的电镜分辨本领可达0.1-0.2nm。电镜的基本构造主要如下：A：电子束照明系统；B：电磁透镜成像系统C：真空系统D：记录系统；E：电源系统。 电镜与光镜的主要区别光镜 电镜 光源 可见光 电子束 介质 空气（香柏油 真空 放大倍数1000倍 百万倍聚光镜 光学透镜 电磁

12、透镜 分辨力 0.30.1um 0.1nm（一）透射电子显微镜（TEM：transmission electron microscope ） 观察标本内部细微结构放大近百万倍 超薄切片 （500埃） 通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片采用重金属盐染色，以增大反差。 负染技术：用重金属盐(如磷钨酸) 染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。冰冻蚀刻（freeze-etching)，或冰冻断裂(freeze-fracture)配合透射电镜观察而设计的一种标本制作技术。

13、研究生物膜内部结构的有用技术。（二）扫描电子显微镜（SEM：scanning electron microscope）观察标本表面形态结构标本特殊处理：固定脱水后，喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。三、扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope, STM)用来显示晶体表面原子布阵的一种显微镜。原理：加上一定电压的精密探针。钨丝或白金丝，直径几个埃。电子在样品与探针之间（距离几个埃）转移形成电流。特点：分辨率高，横向为0.1-0.2nm，纵向为0.001nm.三维图像。三态物质均可观察。高分辨率：具有原子尺度的高分辨率本领，侧分辨率为0

14、.10.2nm，纵分辨率可达0.001nm；直接探测样品的表面结构：可绘出立体三维结构图像；可以在真空、大气、液体（接近于生理环境的离子强度）等多种条件下工作；非破坏性测量：由于没有高能电子束，对表现没有破坏作用（如辐射、热损伤等），能对生理状态下的生物大分子和活细胞膜表面的结构进行研究，样品不会受到损伤而保持完好；扫描速度快，获取数据的时间短，成像快。形态学观察与细胞组分分析结合是细胞生物学研究中常用的实验方法。揭示生物大分子在细胞中的空间定位、相互关系和功能。2.细胞及其组分的分析方法 细胞组分分析的主要方法一、离心技术(一 ) 、细胞破碎:(二）、差速离心（differential ce

15、ntrifugation）在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。 差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离。 速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 （三）、密度梯度离心（density gradient centrifugation）：1、速度沉降（velocity sedimentation）:v 用途:用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器 v 特点:介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度 v 原理:介质密度梯度十分平缓,生物颗粒（细胞或细器）按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离 2、等密

16、度沉降 （isopycnic sedimentation）: 用途:用于分离密度不等的颗粒 特点: 介质密度较高,陡度大,介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度;所需要的力场通常比速率沉降法大10100倍，故往往需要高速或超速离心 原理: 细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力或足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离 高速离心：1000025000r/min 超速离心：转速大于25000r/min；沉降系数（ “S”Svedberg unit）: 单位离心场中溶质分子的沉降速度,以每单位重力的沉降时间表示，1S 相当于11

17、0-13s二、细胞化学和组织化学技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法细胞化学染色是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，从而对某种成分进行研究和分析。细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。三、免疫细胞化学（immunocytochemistry)特异蛋白抗原的定位与定性是根据免疫学原理，利用抗体同特异抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子结合的小分子；抗体则是细胞针对特异的抗原分泌的蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。 (一) 免

18、疫荧光技术（immunofluorescent technique） P40荧光素 : 异硫氰酸荧光素（fluoreceinisothiocyante，FITC），为黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，有两种异构体，易溶于水和酒精等溶剂。分子量为389，最大吸收光谱为490495，最大发射光谱为520530urn，呈现明亮的绿色荧光，是最常用的标记抗体的荧光素。 (二) 免疫电镜技术 免疫酶标技术: 辣根过氧化物酶 免疫胶体金技术: 金胶体颗粒， 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是

19、蛋白质等高分子（二抗）被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固 结合。免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒。（P41原理）蛋白质印迹法（Western blotting）技术路线 ： 样品制备样品分离样品转移免疫反应检测蛋白质由SDS聚丙烯凝胶硝酸纤维素膜转移的过程即为印迹（blotting）四、细胞内外特异核酸序列的定位与定性分子杂交（molecular hybridization） 可用来测定单链分子

20、核苷酸序列间是否具有互补关系 原理 ：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA, DNA-RNA或 RNA-RNA杂交的双链分子。方法：原位杂交 体外分析核酸的主要方法 Southern blotting又称DNA印迹法 Northern blotting又称RNA印迹法Southern blotting DNA 琼脂糖凝胶电泳转膜探针杂交游离探针洗涤放射自显影 了解基因状态（是否有点突变，扩增重排等）Northern blotting 是否含有基因的转录产物原位杂交（in situ hybridization)：在不破坏细胞或细胞器的情况下，

21、用核酸探针检测特定核苷酸序列在染色体上的精确位置的技术。染色体在高pH值条件下，DNA解链，带标记的核酸探针即刻与染色体一定部位杂交。既可检测DNA序列，也可检测RNA序列。五、流式细胞术定量细胞化学分析 仪器：流式细胞仪flow cytometer 特点：细胞是高速运动的 主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞。流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下,，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转

22、换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99% 包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer） 第四章 细胞质膜1.生物膜的基本特征 2.如何证明膜的流动性3.内在膜蛋白跨膜结构域与膜脂结合的具体作用方式 1.生物膜的基本特征， 生物膜(biomembrane) 质膜、细胞内膜、线粒体、叶绿体的膜等统称为生物膜目前对生物膜结构认识的归纳（1）磷脂分子以疏水性尾部相对，极性头部朝向水相组成生物膜骨架。（2）蛋白质或嵌在脂双层表面，或嵌在其内部，或横跨整个脂双层，表现出分布的不对称性。膜蛋白与膜脂、膜蛋白与膜蛋白

23、之间存在复杂的相互作用。形成了赖以完成多种功能的脂筏、纤毛和微绒毛等结构。（蛋白分子以不同的方式镶嵌在脂双层分子中或结合在表面，蛋白的类型，蛋白分布的不对称性及其与脂分子的协同作用赋予生物膜具有各自的特性与功能）；（3）细胞膜由流动的脂双层和嵌在其中的蛋白质组成生物膜基本特征与功能一、质膜的流动性: 膜脂和蛋白质的分子运动组成。（1）膜脂分子的运动相变（phase transition）：脂双层由流动性较大的液晶态到凝胶化的晶态的相互转变称为相变，引起相变的温度称相变温度。（2） 膜蛋白的流动性1、荧光抗体免疫标记实验（细胞融合技术 ）; 2、成斑现象或成帽现象;3、荧光漂白恢复技术二、质膜的

24、不对称性 质膜内外两层的组分和功能有明显的差异(1)膜脂的不对称性：同一种膜脂分子在双层中不均匀分布(2)膜蛋白的不对称性： 每种膜蛋白分子在细胞膜上都具有明确的方向性和分布的区域性 (3)复合糖的不对称性：糖脂和糖蛋白只分布于细胞膜的外表面。 2.如何证明膜的流动性 p64怎样证明细胞膜的膜蛋白具有流动性。质膜的流动性膜脂和蛋白质的分子运动组成1、荧光抗体免疫标记实验（细胞融合技术 ）2、成斑现象或成帽现象3、荧光漂白恢复技术3.简述内在膜蛋白跨膜结构域与膜脂结合的具体作用方式。3.内在膜蛋白跨膜结构域与膜脂结合的具体作用方式 内在膜蛋白跨膜结构域与膜脂结合的主要部位，具体作用方式如下跨膜结

25、构域 (1) 单次跨膜蛋白螺旋20个左右的疏水氨基酸残基形成螺旋，蛋白质外侧为疏水侧链，通过范德华力与脂双分子层脂肪酸链相互作用。（2）跨膜亲水通道多个螺旋形成特异性分子跨膜通道，外侧是非极性链，与膜脂相互作用，内侧是极性链，形成通道。 （3）跨膜亲水通道多个折叠片组成主要存在于大肠杆菌外膜的孔蛋白以及线粒体、叶绿体外膜的孔蛋白中。反向平行的折叠片相互作用形成跨膜通道，具有疏水的外侧和亲水的内侧，可允许分子量小于104的小分子通过。内在膜蛋白（整合膜蛋白）与膜脂结合的方式 1、跨膜结构域与脂双层分子的疏水核心相互作用，这是内在膜蛋白与膜脂结合的最主要的结合方式；2、两端携带的正电荷氨基酸残基与

26、磷脂分子带负电的极性头部相互作用3、膜蛋白通过半胱氨酸结合到脂肪酸分子，插入到脂双层之间4、少数蛋白与糖脂共价结合第五章 物质的跨膜运输1.细胞跨膜物质运输的方式及特点（大小分子） 2.主动运输的能量来源 3.质子泵类型及特点 4.受体介导的内吞作用1.细胞跨膜物质运输的方式及特点（大小分子）、试述物质跨膜运输的几种方式及其特点穿膜运输：被动运输、主动运输；膜泡运输：吞噬作用、受体介导内吞作用细胞运输：这种运输主要是细胞与环境间的物质交换胞内运输：是真核生物细胞内膜性细胞器与细胞内环境进行的物质交换跨细胞运输：这种运输是物质穿越细胞的运输物质通过质膜的三种主要途径：被动运输；主动运输；胞吞作用

27、与胞吐作用【1】被动运输: 顺浓度梯度；不消耗能量 类型:（1）简单扩散（自由扩散）: 也叫自由扩散（free diffusion）：沿浓度梯度（或电化学梯度）扩散；不需要提供能量；没有膜蛋白协助。小分子物质以热自由运动的方式顺着电化学梯度或浓度梯度直接通过脂双层进出细胞，不需要细胞提供能量，也无需转运蛋白的协助，顺浓度梯度 ，不耗能，不需要膜蛋白。（2）协助扩散（促进扩散）: 特异的膜转运蛋白“协助”物质转运；载体蛋白介导的协助扩散，顺浓度梯度 ，不耗能，需要膜蛋白。水孔蛋白（Aquaporin，AQP） ：水分子的跨膜通道（协助扩散）协助扩散同简单扩散相比，具有以下一些特点 （1）促进扩散

28、的速度要快几个数量级（2）具有饱和性: 当溶质的跨膜浓度差达到一定程度时，促进扩散的速度不再提高。（3）具有高度的选择性: 如运输蛋白能够帮助葡萄糖快速运输，但不帮助与葡萄糖结构类似的糖类运输【2】主动运输 概念：由载体蛋白介导的物质逆浓度梯度的跨膜转运方式。在膜运输蛋白的帮助下，使被运送物质逆浓度梯度或电化学梯度消耗能量跨越膜的运输方式，介导此运输方式的蛋白全为载体蛋白。特点：逆浓度梯度（逆化学梯度）运输；需要能量；都有载体蛋白。能量来源： 协同运输中的离子梯度动力； ATP驱动的泵通过水解ATP获得能量；光驱动的泵利用光能运输物质，见于细菌。【3】胞吞作用和胞吐作用真核细胞通过内吞作用（e

29、ndocytosis）和外排作用（exocytosis）完成大分子与颗粒性物质的跨膜运输。因货物包被在囊泡中，又称膜泡运输。 2.膜泡运输批量运输：可同时转运一种或一种以上大分子主动运输：涉及生物膜的断裂与融合，需要能量颗粒和大分子物质进出细胞称吞排作用(cytosis)一、 内吞作用endocytosis：2种方式胞吞作用 通过质膜的变形运动将细胞外颗粒或大分子物质包裹在囊泡内运输入细胞内的过程胞饮作用：细胞吞入液体或极小的颗粒物质。摄入液态可溶大分子或极微小颗粒；进入细胞内的物质形成胞饮小泡吞噬作用：细胞内吞较大的固体颗粒物质，如细菌、细胞碎片等，称为吞噬作用二、外排作用exocytosi

30、s胞吐作用（外排作用）细胞内的分泌泡或其他某些膜泡中的物质通过质膜运出细胞的过程。疏水分子：O2、N2、苯；小的不带电荷的极性分子：水、尿素、甘油；大的不带电的极性分子：葡萄糖、蔗糖等；离子： Na+、H+ 、K+ 、HCO3 、Ca 、 Cl物质穿膜的特点与其性质和大小有关： 脂溶性越强越易直接穿膜，如：甾类激素、苯； 小非极性分子能直接穿膜，如：O2、N2脂溶性与分子大小比，前者影响更大。 不带电荷的小极性分子能直接穿膜 如：H2O、乙醇(分子量46)、尿素(分子量60)、甘油(分子量92 ) ； 不带电的大的极性分子和各种离子不能直接穿膜，需依赖膜上运输蛋白。如 ：葡萄糖(分子量180)

31、、Na+2主动运输的能量来源 主动运输的能量来源有哪些途径？能量来源：协同运输中的离子梯度动力； ATP驱动的泵通过水解ATP获得能量；光驱动的泵利用光能运输物质，见于细菌。3.质子泵类型及特点ATP驱动泵和主动运输ATP驱动泵将ATP水解成ADP和无机磷，并利用释放的能量将小分子物质或离子进行跨膜转运。质子泵1、P-type：如植物细胞膜上的H+泵、动物胃表皮细胞的H+-K+泵（分泌胃酸）。 2、V-type：存在于各类小泡膜上，水解ATP产生能量，但不发生自磷酸化，位于溶酶体膜、内体、植物液泡膜上。3、F-type：利用质子动力势合成ATP，即ATP合酶，位于细菌质膜、线粒体内膜、类囊体膜上。F -型泵：H+-ATP酶 质子泵：质子泵是位于细胞膜或细胞内膜上的一种能主动转运质子(H+)的特殊蛋白质.可分为三种：一种是P型质子